Выделение и культивирование первичных фибробластов, полученных из келоидной ткани, являются основой для дальнейших исследований келоидов. Фибробласты из келоидной ткани могут быть легко получены с помощью этого протокола, что может обеспечить обильный и стабильный источник клеток в лаборатории для исследования келоидов. Начните с использования стерильного пинцета, чтобы поместить келоидную ткань в стерильную центрифужную пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую от 10 до 25 миллилитров PBS с добавлением 1% PSA.
Тем временем добавьте четыре миллилитра раствора PBS PSA в каждую лунку шестилуночного планшета. Теперь выньте ткань из тюбика и дважды промойте раствором PBS PSA. С помощью стерильных щипцов последовательно перенесите ткань из одной лунки в другую.
Затем хирургическими ножницами удаляют жировой слой и слой эпидермиса, оставляя дерму нетронутой. С помощью ножниц рассеките подстриженную дерму на кусочки размером от трех до пяти квадратных миллиметров и перенесите кусочки в следующую лунку с помощью стерильных щипцов. Вымойте кусочки в растворе PBS PSA.
Стерилизованными щипцами поместите от 10 до 30 кусочков ткани дермы на расстоянии менее пяти миллиметров друг от друга в чашки Петри. Поставьте посуду вверх дном в инкубатор, пока кусочки не высохнут и не прилипнут к блюду. Далее добавляют семь миллилитров ДМЭМ с добавлением 10%ФБС и 1%ПСА и инкубируют блюда, как и раньше.
Через трое суток замените половину надосадочной жидкости полной питательной средой. Ежедневно наблюдайте за фибробластами под 40-кратным микроскопическим увеличением. Удалите кусочки ткани в питательной среде, когда фибробласты достигнут 90% слияния.
Промойте фибробласты в PBS и добавьте два миллилитра стерильного раствора трипсина ЭДТА. После инкубации клеток в увлажненном инкубаторе осторожно постучите по чашке с культурой и понаблюдайте за ней под микроскопом. Добавьте два миллилитра полной среды, чтобы закончить пищеварение, как только большая часть клеток отделится.
Теперь перенесите клеточную суспензию в стерильную центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров и центрифугируйте пробирку при 300 г в течение трех минут при комнатной температуре. Осторожно выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в полной среде. Засейте фибробласты в девятисантиметровую чашку для клеточных культур и инкубируйте в увлажненном инкубаторе.
Для проведения иммунофлуоресцентного анализа после культивирования фибробластов на круглых покровных стеклах и инкубации их в первичных и вторичных антителах добавляют 50 микролитров раствора DAPI к предметному стеклу для окрашивания клеточных ядер. Поместите вымытые покровные стекла на предметные стекла с помощью щипцов. Наконец, перенесите образцы во влажный темный ящик для флуоресцентной микроскопии.
Фибробластные разрастания ткани наблюдались через пять суток после обработки. Фибробласты показали высокую скорость пролиферации и достигли слияния через 10 дней. Фибробласты имели удлиненные и веретенообразные клеточные тела, которые были выровнены в пучки при высокой слиянии.
Иммунофлуоресцентное окрашивание дало положительную красную иммунофлюоресценцию фибробластов и синюю иммунофлюоресценцию клеточного ядра. Проточные цитометрические анализы показали положительность CD90 почти во всех фибробластах. В этом исследовании описан оптимизированный метод и даны четкие инструкции для решения существующих проблем и повышения шансов на успех при выделении и культивировании келоидных фибробластов.
