Грант SNSF 310030_219210 для J.H.N. поддержал публикацию этой рукописи без ограничений. Рисунок 1 был создан с помощью BioRender.com.

Процедуры были одобрены комитетом по этике Северо-Западной и Центральной Швейцарии (EKNZ; Идентификатор проекта 2019-00273). Все пациенты предоставили письменное информированное согласие на экспериментальное использование биопсии до проведения эндоскопического исследования. Реагенты и оборудование, использованные в исследовании, перечислены в Таблице материалов.
1. Выделение клеток для органоидов пищевода, полученных от пациента
Примечание: Список составляющих среды для культивирования органоидов пищевода человека приведен в таблице 1.
<ol><li>Получите биопсию. ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании две биопсии из одного сегмента пищевода получены во время эзофагогастродуоденоскопии с использованием биопсийных щипцов с использованием гастроскопа с рабочим каналом 2,8 мм.</li>
	<li>Перенос биопсии в коммерчески доступную среду без кератиноцитарной сыворотки (KSFM; Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE). ПРИМЕЧАНИЕ: Биопсия может храниться на льду в течение нескольких часов до использования.</li>
	<li>Замените среду KSFM 1 мл Dispase I (10 Ед/мл) и инкубируйте биопсию в течение 10 минут при комнатной температуре.</li>
	<li>Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.</li>
	<li>Аспирируйте диспазу с помощью пипетки объемом 1000 μл, не касаясь биопсии и гранул клеточного мусора.</li>
	<li>Промойте биопсию 1 мл фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS).</li>
	<li>Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.</li>
	<li>Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 μл.</li>
	<li>Биопсию инкубируют с 500 мкл трипсина-ЭДТА (0,05%) при 37 °C в течение 10 минут, встряхивая при 800 об/мин.</li>
	<li>Выполняйте механическое разрушение путем многократного пипетирования вверх и вниз до получения одноклеточной суспензии.</li>
	<li>Отфильтруйте ячейки через сетчатый фильтр 70 мкм с помощью резиновой головки поршня туберкулинового шприца.</li>
	<li>Промойте ситечко 2-4 мл ингибитора соевого трипсина (250 мкг/мл).</li>
	<li>Отфильтруйте клетки через сетчатое фильтр 35 μм с защелкивающейся крышкой на полистирольной трубке объемом 5 мл с круглым дном.</li>
	<li>Переложите раствор одиночных клеток в коническую пробирку объемом 15 мл.</li>
	<li>Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.</li>
	<li>Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 μл.</li>
	<li>Ресуспендируйте клетки в 100 мкл среды КСФМ.</li>
	<li>Смешайте 10 μL трипанового синего с 10 μL клеточной суспензии.</li>
	<li>Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек.</li>
</ol>2. Культура органоидов, полученных от пациента
<ol><li>Добавьте 1-2 мл КСФМ в клеточную суспензию после подсчета.</li>
	<li>Центрифугируйте при 300 x g в течение 5 мин при 4 °C.</li>
	<li>Аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 мкл, не повреждая клеточную гранулу.</li>
	<li>Ресуспендируйте клеточную гранулу в гидрогелевой матрице экстракта базальной мембраны (BME) (40 μL BME на 20 000 клеток). ПРИМЕЧАНИЕ: После добавления BME держите клетки на льду, чтобы предотвратить преждевременное затвердевание BME.</li>
	<li>Отрежьте наконечник пипетки объемом 200 мкл, чтобы аспирировать вязкую смесь суспензии BME-клеток.</li>
	<li>Сформируйте капли объемом 40 мкл в предварительно нагретой (37 °C) суспензионной клеточной культуральной тарелке.</li>
	<li>Инкубируйте планшет без среды в течение 20-30 минут при 37 °C для обеспечения затвердевания капель BME.</li>
	<li>Добавьте предварительно подогретую среду КСФМ-С с добавлением 10 мкМ Y27632 (ингибитор ROCK) в течение первых двух дней посева.</li>
	<li>Заменяйте среду на новую среду KSFM-C (без интересующего Y27632 и +/- цитокина) через день.</li>
	<li>Отсадите среду и соскребите капли с помощью наконечника пипетки, непрерывно добавляя в лунку 1 мл Dispase II (1,5 Ед/мл).</li>
	<li>Перелейте смесь BME-dispase в центрифужную пробирку объемом 15 мл и инкубируйте ее в течение 20 минут при 37 °C на водяной бане для расщепления BME.</li>
	<li>Центрифугируйте при 250 x g в течение 3 мин при 4 °C и аспирируйте Dispase II.</li>
	<li>Действуйте в соответствии с протоколом интересующего вас считывания (например, выделение РНК, выделение белка или фиксация 4% PFA для гистологии).</li>
</ol>3. Выделение клеток для культур воздушно-жидкостного интерфейса пациента (ALI)
<ol><li>Получите биопсию. Во время эзофагогастродуоденоскопии с использованием гастроскопа с рабочим каналом 2,8 мм берутся две биопсии из одного сегмента пищевода с помощью биопсийных щипцов.</li>
	<li>Поместите биопсию в коммерчески доступную среду без кератиноцитарной сыворотки (KSFM; Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE) и хранить на льду в течение нескольких часов до использования.</li>
	<li>Замените КСФМ на 1 мл диспазы (10 Ед/мл). После этого инкубируйте биопсию в течение 10 минут при комнатной температуре.</li>
	<li>Центрифугируйте биопсию при комнатной температуре 300 x g в течение 2 минут.</li>
	<li>Удалите Dispase с помощью пипетки объемом 1000 μл, не касаясь биопсии и гранул клеточного мусора.</li>
	<li>Промойте биопсию 1 мл DPBS.</li>
	<li>При комнатной температуре биопсию можно замедлить при 300 x g в течение 2 минут.</li>
	<li>Отсадите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1000 мкл.</li>
	<li>Инкубируйте биопсию в 500 мкл Trypsin-EDTA (0,05%) при 37 °C в течение 10 минут и непрерывно перемешивайте при 800 об/мин во время инкубации.</li>
	<li>Механическое прерывание биопсии с помощью повторяющегося пипетирования вверх и вниз до получения суспензии одиночных клеток.</li>
	<li>Пропустите диссоциированные клетки через клеточный фильтр 70 мкм с резиновой головкой поршня из туберкулинового шприца и соберите клетки в коническую трубку объемом 50 мл.</li>
	<li>Промойте ситечко 2-4 мл ингибитора соевого трипсина (250 мкг/мл), чтобы удалить оставшиеся клетки из ситечка.</li>
	<li>Отфильтруйте ячейки с помощью защелкивающегося колпачка из сетчатого фильтра 35 мкм в полистирольную пробирку с круглым дном объемом 5 мл.</li>
	<li>Перенесите клетки в коническую пробирку объемом 15 мл.</li>
	<li>Центрифуга при 300 x g при 4 °C в течение 5 минут.</li>
	<li>Удалите надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 1 000 мкл.</li>
	<li>Ресуспендировать клеточную таблетку в 4 мл среды КСФМ (Ca2+ 0,09 мМ), в том числе 10 мкМ Y27632.</li>
	<li>Перенесите клетки в колбу для клеточных культур T25.</li>
	<li>Чтобы увеличить первичные кератиноциты, культивируйте клетки до слияния 60%-80% в течение примерно 1 недели. Примечание: Пассаж (P)0 образует островковые клеточные конгломераты и не является монослоем. Первичные кератиноциты образуют монослои, начиная с P1.</li>
	<li>Пассаж при конфлюенции 60%-80% и повторный посев P1 в 2-3 колбы T25 или 1-2 колбы с клеточными культурами T75.</li>
	<li>Пассаж Р1 снова, когда кератиноциты образуют монослой с конфлюенсацией 60%-80%.</li>
</ol>4. Культура воздушно-жидкостного интерфейса пациента (ALI)
<ol><li>Посев первичных кератиноцитов P2 на трансвелловые вкладыши для культуры ALI. ПРИМЕЧАНИЕ: Засейте 400 000 клеток в 12 луночных вставок (200 000 кератиноцитов на 0,6 см2) в 500 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).<ol><li>Засемените 150 000 клеток в 24 луночные вставки (155 000 кератиноцитов на 0,5 см2) в 100 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).</li>
		<li>В качестве альтернативы можно заморозить в среде KSFM (Ca2 + 0,09 мМ + 10% ДМСО) при температуре -80 °C в течение 24 часов, а затем перенести замороженные элементы в жидкий азот для последующего использования. ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании замороженных флаконов проведите еще раз после размораживания перед использованием клеток для культуры ALI.</li>
	</ol></li>
	<li>Добавьте среду в нижнюю лунку под вставкой транслуночной питательной пластины. ПРИМЕЧАНИЕ: Для 12-луночных планшетов: 1,5 мл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE). Для 24-луночных планшетов: 600 мкл KSFM (Ca2+ 0,09 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE).</li>
	<li>Замените KSFM со средним и высоким содержанием кальция (Ca2+ 1,8 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE) через 2 дня.</li>
	<li>Меняйте среду с высоким содержанием кальция КСФМ через день до 7 дня.</li>
	<li>На 7-й день выполните эрлифтинг, отасунув среду из верхней камеры и заменив среду в нижней камере на KSFM с высоким содержанием кальция (Ca2+ 1,8 мМ, 1 нг/мл EGF, 50 мкг/мл BPE), содержащим 10 нг/мл KGF (=FGF7), 75 мкг/мл аскорбиновой кислоты (АК).<ol><li>Необязательно: Добавьте в среду интересующий цитокин в желаемой концентрации.</li>
	</ol></li>
	<li>Меняйте носитель каждый второй день до 14 дня.</li>
</ol>5. Измерение трансэпителиального электрического сопротивления (TEER)
<ol><li>Простерилизовать электрод измерителя TEER, погрузив его в лунку 24-луночного планшета с 5% гипохлоритом натрия на 10-15 мин.</li>
	<li>Смойте 5% гипохлорит натрия, погрузив электрод в 4 последовательные лунки со стерильным ddH,2O и дав электроду высохнуть на воздухе.</li>
	<li>Установите заготовку, поместив один электрод в лунку, а второй электрод в транслунную вставку, заполнив ее PBS и измерив TEER. ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые объемы для измерений TEER: Для планшета с 12 лунками (1900 μL в лунке и 900 μL во вкладыше). Для 24-луночного планшета (750-1000 μL в лунке и 250 μL во вкладыше).</li>
	<li>Замените среду культур ALI стерильной PBS комнатной температуры. ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите среду из нижнего луночного отверстия и, на втором этапе, из вкладыша через колодец. Аналогичным образом добавьте PBS сначала во вкладыш, а затем в нижнюю лунку, чтобы предотвратить отслоение культуры ALI от трансвелловой мембраны.</li>
	<li>Поместите электроды счетчика TEER в экспериментальные лунки с культурами ALI и выполните измерение TEER1. ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте измерения TEER каждые два дня перед сменой среды.</li>
</ol>6. Макромолекулярный поток
<ol><li>Разбавить исходный раствор ФИТК-декстрана (3-5 кДа) до рабочей концентрации 1 мг/мл. ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда защищайте FITC-Dextran от воздействия света.</li>
	<li>Подготовьте ряд для разбавления с уменьшающейся концентрацией FITC (от 1000 мкг/мл до 0,25 мкг/мл) в качестве стандарта для считывания.</li>
	<li>Добавьте 500 мкл раствора FITC-декстрана (1 мг/мл) в верхнюю камеру трансвелла и 1,5 мл среды (+/- интересующий цитокин) в нижний отсек и поместите планшет в инкубатор.</li>
	<li>Соберите 120 мкл среды из нижнего отсека в соответствующие моменты времени (например, 0 мин, 15 мин, 30 мин, 60 мин, 90 мин, 120 мин, 150 мин и 180 мин).</li>
	<li>Пипетка дублирует (50 мкл/лунку) каждого временного момента в черную 96-луночную прозрачную пластину с плоским дном.</li>
	<li>Возбуждайте FITC-декстран на длине волны 490 нм и считывайте излучение на длине волны 520 нм с помощью считывателя пластин.</li>
	<li>Рассчитайте количество потока высокомолекулярных соединений в соответствии со стандартом.</li>
</ol>

Human Esophageal Organoids and Air-Liquid Interface Culture Protocols

Авторам нечего раскрывать.

Проводимые процедуры позволяют культивировать органоиды и культуры ОЛ пациентского происхождения с высокими перспективами успеха. Протокол на основе органоидов был взят из первого опубликованного протокола, в котором сообщалось о создании органоидов пищеводачеловека26...

Воспаление пищевода нарушает целостность эпителиального барьера 1,2,3,4,5, что наблюдается при эозинофильном эзофагите (ЭоЭ), хроническом воспалительном заболевании пищевода с преобладанием Th26. EoE был впервые описан в 1990-х годах как 7,8 и индуцируется преимущественно пищевыми антигенами 9,10,11,12,13. Наиболее часто встречающимися симптомами ЭоЭ у взрослого населения являются дисфагия и пищевая имперация14. У детей ЭоЭ обычно проявляется отставанием в росте, отказом от пищи, рвотой и болью в животе15. Полногеномные ассоциативные исследования (GWAS) выявили гены риска EoE, участвующие в целостности эпителиального барьера, переместив эпителий в центр исследований EoE 16,17,18. Транскриптомика EoE также показала, что нарушение процесса дифференцировки и гиперплазия реактивной базальной зоны вызывают нарушение барьерной функции эпителия пищевода 3,5,19,20,21,22. Раннее понимание того, что ЭоЭ является Th2-опосредованнымзаболеванием6, привело к открытию IL-13 в качестве движущего медиатора, нарушающего целостность эпителия 3,4,21,23. Экспериментальные системы, позволяющие препарировать цитокин-опосредованные эффекты на целостность эпителия от нарушения внутреннего барьера через генетическую предрасположенность, дают возможность изучить сложное взаимодействие между иммунными клетками и эпителием в ЭоЭ. Пищеводные органоиды человека и культуры воздушно-жидкостного интерфейса (ОПЛ) были предложены в качестве ценных инструментов для анализа влияния цитокиновой стимуляции на целостность эпителия5.
Первый протокол для получения взрослых тканеспецифических стволовых клеток (ASC) пищеводных органоидов был разработан через пять лет после первых опубликованных сообщений о кишечных органоидах в 2009 году с использованием кишечных Lgr5+ ASC, повторяющих эпителиальный компартмент тонкой кишки24. ДеВард и др. первыми получили органоиды из эпителиальных клеток пищевода мышей25. В 2018 году Kasagi et al. получили органоиды пищевода человека из иммортализованной клеточной линии плоского эпителия пищевода человека EPC2-hTERT и первичных клеток, полученных от пациента26. В том же году Zhang et al. успешно получили индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (iPSC), полученные из органоидов пищевода. Они определили значение ингибирования TGFβ и костного морфогенетического белка (BMP) для развития клеток-предшественников пищевода (EPC) и решающую роль передачи сигналов Notch в дифференцировке стратифицированного плоского эпителия26,27. Трисно и его коллеги дополнили эти результаты, определив Sox2 в качестве ингибитора Wnt, который направляет судьбу развития в сторону дифференцировки пищевода. Последующее усовершенствование протоколов, состава среды и условий культивирования увеличило скорость образования органоидов и сделало возможным субкультивирование и восстановление органоидов после криоконсервации 26,29,30,31,32. Несмотря на то, что эти органоиды являются мощными инструментами для изучения архитектуры тканей и экспрессии потенциальных генов-мишеней после стимуляции цитокинами, органоиды пищевода не дают возможности измерить трансэпителиальную резистентность (TEER) или поток макромолекул в качестве прямых измерений целостности барьера. Как ранее было описано Шерриллом и коллегами22, культуры ALI, моделирующие дифференцировкуэпителия4, позволяют напрямую оценить целостность эпителия. Объединение органоидов, полученных от пациента, и культур ALI является мощным инструментом для исследования архитектуры тканей и целостности эпителиального барьера в EoE.
Ниже приведены процедуры с инструкциями по выделению жизнеспособных клеток из биопсии пищевода и созданию органоидов пищевода и культур ОПЛ, которые в дальнейшем могут быть использованы для изучения влияния цитокинов на целостность барьера.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1250 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4445</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300 &#181;L Griptip - Filter</td>
			<td>Integra</td>
			<td>4435</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;M cell strainer</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>83.3945.070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ascorbic Acid</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>A4544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine pituitary extract</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>21115</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Culture Multiwell Plates CELLSTAR for suspension cultures</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>7.657 185</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cultrex Basement Membrane Extract (BME), Type 2, Pathclear</td>
			<td>R&#38;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>3532-010-02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide (DMSO), >99,5% BioScience Grade</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>A994</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase I</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase II</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D4693</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbeccos Phosphate Buffered Saline&#160; (DPBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>D8537</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Automated Cell Counter</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVE-MC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EVE Cell counting slide</td>
			<td>NanoEntek</td>
			<td>EVS-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescin isothiocyanate (FITC)-dextran</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>FD4</td>
			<td>average mol wt 3000-5000</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heraeus - Megafuge&#160; 40R&#160;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>75004518</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Human recombinant epidermal growth factor</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>3700015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Keratinocyte-SFM</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>17005042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-Streptomycin</td>
			<td>Gibco (Thermo Fischer Scientific)</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Recombinant Human KGF/FGF-7 Protein</td>
			<td>R&amp;D Systems (Bio-Techne)</td>
			<td>251-KG-010/CF</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Screw cap tube, 15 mL</td>
			<td>Sarstedt</td>
			<td>62.554.502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 100-1000 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3018</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Single Channel EVOLVE 20-200 &#181;L&#160;</td>
			<td>Integra</td>
			<td>3016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe 1 mL</td>
			<td></td>
			<td>1134950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ThermoMixer C</td>
			<td>Eppendorf</td>
			<td>5382000015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean)</td>
			<td>Sigma-Aldrich (Merck)</td>
			<td>T9128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin-EDTA</td>
			<td>SAFC Biosciences (Merck)</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Y27632 dihydrochloride</td>
			<td>Tocris (Bio-Techne)</td>
			<td>1254</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

three-dimensional cell culture models to investigate the epithelial barrier in eosinophilic esophagitis 

Плоский эпителий пищевода подвергается непосредственному воздействию окружающей среды, постоянно сталкиваясь с чужеродными антигенами, включая пищевые антигены и микробы. Поддержание целостности эпителиального барьера имеет решающее значение для предотвращения инфекций и предотвращения воспаления, вызванного безвредными антигенами пищевого происхождения. В данной статье представлены упрощенные протоколы получения органоидов пищевода человека и культур воздушно-жидкостных границ раздела из биопсии пациента для изучения эпителиального компартмента пищевода в контексте тканевого гомеостаза и заболевания. Эти протоколы стали важными научными вехами за последнее десятилетие, описывая трехмерные органоподобные структуры из первичных клеток, полученных от пациента, органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела. Они дают возможность исследовать функцию специфических цитокинов, факторов роста и сигнальных путей в эпителии пищевода в трехмерной структуре, сохраняя при этом фенотипические и генетические свойства донора. Органоиды предоставляют информацию о микроархитектуре тканей путем оценки транскриптома и протеома после цитокиновой стимуляции. В отличие от этого, культуры на границе раздела воздух-жидкость позволяют оценить целостность эпителиального барьера с помощью трансэпителиального сопротивления (TEER) или измерения потока макромолекул. Объединение этих органоидов и культур воздушно-жидкостных границ раздела является мощным инструментом для продвижения исследований в условиях нарушенного эпителиального барьера пищевода.

Esophageal inflammation compromises the epithelial barrier integrity1,2,3,4,5, as observed in eosinophilic esophagitis (EoE), a Th2-dominated chronic inflammatory disease of the esophagus6. EoE was first described in the 1990s7,8 and is predominantly induced by food antigens9,10,11,12,13. The most frequently occurring symptoms of EoE in the adult population are dysphagia and food impaction14. In children, EoE typically manifests with failure to thrive, food refusal, vomiting, and abdominal pain15. Genome-wide association studies (GWAS) have identified EoE risk genes involved in epithelial barrier integrity, moving the epithelium into the focus of EoE research16,17,18. EoE transcriptomics further revealed that an impaired differentiation process and a reactive basal zone hyperplasia cause the compromised barrier function of the esophageal epithelium3,5,19,20,21,22. The early understanding of EoE being a Th2-mediated disease6 led to the discovery of IL-13 as a driving mediator by disturbing epithelial integrity3,4,21,23. Experimental systems allowing the dissection of cytokine-mediated effects on epithelial integrity from intrinsic barrier impairment through genetic predisposition provide the possibility to study the complex interplay between immune cells and the epithelium in EoE. Human esophageal organoids and air-liquid interface (ALI) cultures have been proposed as valuable tools to analyze the consequence of cytokine stimulation on epithelial integrity5.
The first protocol for generating adult tissue-specific stem cell (ASC)-derived esophageal organoids was established five years after the first published reports of intestinal organoids in 2009 using intestinal Lgr5+ ASCs recapitulating the epithelial compartment of the small intestine24. DeWard et al. pioneered generating organoids from murine esophageal epithelial cells25. In 2018, Kasagi et al. generated human esophageal organoids from the immortalized human esophageal squamous epithelium cell line EPC2-hTERT and primary patient-derived cells26. In the same year, Zhang et al. successfully generated induced pluripotent stem cell (iPSC)-derived esophageal organoids. They delineated the significance of TGF&#946; and bone morphogenetic protein (BMP) inhibition for esophageal progenitor cell (EPC) development and the crucial role of Notch signaling in the differentiation of the stratified squamous epithelium26,27. Trisno and colleagues complemented these findings by identifying Sox2 as a Wnt inhibitor that directs the developmental fate towards esophageal differentiation28. The subsequent refinements of protocols, medium composition, and culture conditions increased the organoid formation rate and made subculturing and recovering organoids after cryopreservation possible26,29,30,31,32. Although these organoids are powerful tools for studying tissue architecture and expression of potential target genes after stimulation with cytokines, esophageal organoids will not offer the possibility to measure transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux as direct measures for barrier integrity. As previously described by Sherrill and colleagues22, ALI cultures modeling epithelial differentiation4&#160;allow direct assessments of epithelial integrity. Combining patient-derived organoids and ALI cultures is a powerful tool for investigating tissue architecture and epithelial barrier integrity in EoE.
Here are procedures with instructions for isolating viable cells from esophageal biopsies and establishing esophageal organoid and ALI cultures that can further be used to study the effects of cytokines on barrier integrity.

Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

Трехмерные модели клеточных культур для исследования эпителиального барьера при эозинофильном эзофагите 

Органоиды пищевода будут расти из первичных клеток, извлеченных из биопсии пациента в соответствии с инструкциями предоставленного протокола, как задокументировано с помощью инвертированного светлопольного микроскопа (Рисунок 1). Эпителиальные ASC начинают образовыва...

Read this Scientific Article Protocol about Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis at JoVE.com

Здесь представлен протокол культивирования органоидов пищевода человека и культуры границы раздела воздух-жидкость. Культура воздушно-жидкостного интерфейса органоидов пищевода может быть использована для изучения влияния цитокинов на эпителиальный барьер пищевода.

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and ...

Мы исследуем патофизиологию эозинофильного эзофагита и пытаемся разгадать воспалительный каскад, вызывающий и способствующий хроническому воспалительному процессу ЭОЭ. Идентификация новых иммунных медиаторов, способствующих патогенезу заболевания, была сосредоточена вокруг нарушения эпителиального барьера и одобрения терапевтических антител против указанных иммунных медиаторов. Мы идентифицировали цитокины подсемейства IL-20 как медиаторы воспаления, которые нарушают эпителиальную дифференцировку и кератинизацию, что приводит к нарушению эпителиального барьера через путь MAP-киназы.

three-dimensional-cell-culture-models-to-investigate-epithelial

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Anatomy and Physiology

Immunology and Infection

Three-Dimensional Cell Culture Models to Investigate the Epithelial Barrier in Eosinophilic Esophagitis 

Unit 1

Digestive System

SCIENTISTS IN ACTION

442 Views.  University of Basel. Мы исследуем патофизиологию эозинофильного эзофагита и пытаемся разгадать воспалительный каскад, вызывающий и способствующий хроническому воспалительному процессу ЭОЭ. Идентификация новых иммунных медиаторов, способствующих патогенезу заболевания, была сосредоточ...

Video: Author Spotlight: Investigating the Pathophysiology of Eosinophilic Esophagitis

The squamous epithelium of the esophagus is directly exposed to the environment, continuously facing foreign antigens, including food antigens and microbes. Maintaining the integrity of the epithelial barrier is critical for preventing infections and avoiding inflammation caused by harmless food-derived antigens. This article provides simplified protocols for generating human esophageal organoids and air-liquid interface cultures from patient biopsies to study the epithelial compartment of the esophagus in the context of tissue homeostasis and disease. These protocols have been significant scientific milestones in the last decade, describing three-dimensional organ-like structures from patient-derived primary cells, organoids, and air-liquid interface cultures. They offer the possibility to investigate the function of specific cytokines, growth factors, and signaling pathways in the esophageal epithelium within a three-dimensional framework while maintaining the phenotypic and genetic properties of the donor. Organoids provide information on tissue microarchitecture by assessing the transcriptome and proteome after cytokine stimulation. In contrast, air-liquid interface cultures allow the assessment of the epithelial barrier integrity through transepithelial resistance (TEER) or macromolecule flux measurements. Combining these organoids and air-liquid interface cultures is a powerful tool to advance research in impaired esophageal epithelial barrier conditions.

Here, a protocol for the culture of human esophageal organoids and air-liquid interface culture is provided. Esophageal organoids' air-liquid interface culture can be used to study the impact of cytokines on the esophageal epithelial barrier.