В этом протоколе мы стремимся предоставить простое для понимания, пошаговое руководство о том, как собирать и хранить высокожизнеспособную периферическую кровь и мононуклеарные клетки (PBMC) из цельной крови. PBMC включают лимфоциты, дендритные клетки и моноциты. Объемные PBMC могут быть обработаны для выделения отдельных типов клеток и обычно используются в широком спектре экспериментов и анализов, включая секвенирование РНК и проточную цитометрию.
В дополнение к PBMC мы также демонстрируем, как собирать плазму ЭДТА и целую охристую шерсть. Прежде чем приступить к применению этого протокола, подготовьте материалы и реагенты, перечисленные в таблице 2. Обратите внимание, что этот протокол предназначен для сбора PBMC из шести центрифугирующих пробирок с градиентом плотности, каждая из которых дает примерно 12 миллионов клеток.
Масштабируйте соответственно. Используя стандартную технику флеботомии, соберите цельную кровь в шесть пробирок центрифугирования с градиентом плотности и одну пробирку ЭДТА до полного заполнения. Центрифугируйте все пробирки при 1800г в течение 20 минут при комнатной температуре.
При необходимости собранные пробирки могут храниться до четырех часов и затем одновременно обрабатываться. В дополнительном видео 1 показано, как работать с центрифугой. После центрифугирования пробирки, содержащей среду с градиентом плотности, плазма и PBMC будут находиться выше среды с градиентом плотности.
Эритроциты и гранулоциты осядут на дно. Визуализация приведена на рисунке 1A. После центрифугирования осторожно откройте пробирку для центрифугирования с градиентом плотности.
С помощью трансферной пипетки удалите и выбросьте полупрозрачный желтый слой, содержащий плазму. Не тревожьте туманный слой клеток непосредственно над градиентом плотности среды. Ошибайтесь в сторону того, чтобы оставлять избыток плазмы, а не выбрасывать PBMC.
Повторите для всех трубок. С помощью новой трансферной пипетки пипетка осторожно поднимает и опускает оставшийся объем клеток и остаточной плазмы в каждой пробирке вверх и вниз в несколько раз выше градиента плотности. После ресуспендирования пипеткой ресуспендированное содержимое пробирки в коническую пробирку с маркировкой объемом 50 мл.
Повторите для всех трубок. Заполните пробирку объемом 50 мл до линии 50 мл раствором 1 путем заливки. Центрифугируйте пробирку объемом 50 мл при температуре 300 г в течение 10 минут при комнатной температуре.
Протокол сбора плазмы и баффи, подробно описанный в разделе 2, может быть завершен в течение этого времени. После центрифугирования гранула содержит PBMC, а надосадочная жидкость — тромбоциты и остаточную плазму. Выбросьте как можно больше надосадочной жидкости.
Постукивайте по мере необходимости, чтобы удалить остатки капель. Налейте 15 мл раствора 2 в коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую гранулу PBMC. Аккуратно переверните трубку, чтобы снова суспендировать гранулу.
Отсадите 15 мл раствора 3 с помощью трансферной пипетки. Добавьте по каплям в тюбик объемом 50 мл. Раствор 3 содержит ДМСО, который токсичен для клеток при комнатной температуре.
Не добавляйте раствор 3 до тех пор, пока он не будет готов для немедленной обработки. Осторожно переверните трубку три раза, чтобы перемешать. Наполните каждый предварительно маркированный и предварительно охлажденный криофлакон 1 мл PBMC с помощью дозирующей пипетки.
В дополнительном видео 2 показано, как работать с многодозирующим дозатором. Поместите криофлаконы в предварительно охлажденный контейнер для заморозки. Затем переместите контейнер в морозильную камеру с отрицательным температурой 80 градусов по Цельсию.
Храните криофлаконы внутри контейнера для заморозки не менее 12 часов. Затем переложите в маркированный ящик для хранения при температуре минус 80 градусов по Цельсию. В качестве альтернативы можно перенести замороженные криопробирки в жидкий азот для длительного хранения.
После центрифугирования верхний слой состоит из плазмы, нижний – из эритроцитов, а на границе раздела – охристые оболочки. Визуализация приведена на рисунке 1B. С помощью новой переводной пипетки наберите как можно больше плазмы, не нарушая охристый слой шерсти.
Затем распределите 0,5 мл аликвот в предварительно маркированные криопробирки. Отсадите охристый слой шерсти и переложите его в криофлакон с соответствующей маркировкой. Обратите внимание, что некоторые плазмы и эритроциты могут загрязнять коллекцию охристой шерсти.
После сбора храните криофлаконы в морозильной камере с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия. В качестве альтернативы можно хранить в жидком азоте для длительного хранения. Перед началом протокола размораживания ПБМК подготовьте материалы и реагенты, перечисленные в таблице 3.
Этот протокол предназначен для размораживания одной пробирки объемом 1,5 мл, содержащей около 2 миллионов клеток. Масштабируйте соответственно. Обратите внимание, что абсолютное количество клеток может значительно отличаться у разных пациентов и при разных условиях лечения.
Переложите замороженные PBMC из хранилища с помощью сухого льда и разморозьте в инкубаторе с температурой 37 градусов Цельсия в течение примерно 4 минут. При желании может быть взята аликвота для подсчета клеток и измерения жизнеспособности, как подробно описано в разделе 4 письменного протокола. После размораживания добавьте по 1 мл раствора 4 в каждый криофлакон.
Затем вылейте содержимое в предварительно маркированную пробирку объемом 50 мл, содержащую 10 мл раствора 4 на каждую размороженную пробирку PBMC. Нажмите, чтобы удалить остатки капель. Поместите клеточный фильтр на пустую пробирку объемом 50 мл, а затем вылейте клеточную суспензию через клеточный фильтр.
При необходимости слегка постучите, чтобы нарушить поверхностное натяжение. Центрифугируйте каждую пробирку, содержащую процеженные клетки, при плотности 400 г в течение 7 минут при комнатной температуре. После центрифугирования вылейте надосадочную жидкость, содержащую ДМСО.
Постукивайте по мере необходимости, чтобы удалить остатки капель. Ресуспендируйте клеточную гранулу в желаемой среде, подходящей для последующих экспериментальных потребностей, таких как среда для культивирования клеток или коктейли антител для проточной цитометрии. Продолжайте эксперимент.
После сбора и криоконсервации PBMC жизнеспособность размороженных PBMC, моноцитов и лимфоцитов из 56 уникальных образцов оценивали методом проточной цитометрии с использованием реагентов, перечисленных в таблице 4, в соответствии с инструкциями производителя, показанными на рисунках 2A, через среднее значение F.A и стандартное отклонение жизнеспособности PBMC, моноцитов и лимфоцитов 94 плюс-минус 4%98 плюс-минус 1,1% и 93 плюс-минус 5,6% соответственно. был достигнут, как показано на рисунке 2G. Измерения жизнеспособности с помощью исключения трипанового синего дали среднюю жизнеспособность 88 плюс-минус 7,5% и количество клеток 2,3 умножить на 10 до 6 плюс-минус 1,9 умножить на 10 на 6. Анализ проточной цитометрии также показал, что живые моноциты составляют 17 плюс-минус 5,9%, а лимфоциты — 53 плюс-минус 13% от общего числа ПМЦ.
Впоследствии моноциты были отсортированы из размороженных PBMC из 59 уникальных образцов с помощью проточной цитометрии и отправлены на библиотечную подготовку и секвенирование РНК, как описано в другом месте. Среднее значение и общее количество последовательностей со стандартным отклонением в 18 плюс-минус 16,3 млн было достигнуто при выравнивании 93 плюс-минус 6,3% прочтения и 49,6 плюс-минус 1,4 GC-содержании, как показано на рисунках 3A и B. Среднее значение и стандартное отклонение однозначно картографировали процент прочтений 88 плюс-минус 3,6% с подмножеством из 56 уникальных образцов. Эти параметры демонстрируют, что высокожизнеспособные PBMC, пригодные для последующих применений, включая высококачественное секвенирование РНК, могут быть получены операторами с любым уровнем лабораторной подготовки, использующими этот протокол.
При выполнении этого протокола критически важно работать быстро, чтобы избежать гибели клеток, особенно после добавления раствора 3, который токсичен для клеток при комнатной температуре. Кроме того, с клетками также необходимо обращаться бережно, чтобы свести к минимуму повреждение. Этот протокол обеспечивает эффективный, простой в использовании метод выделения PBMC, плазмы ЭДТА и охристой шерсти.
Эти иммунные клетки могут быть использованы для широкого спектра экспериментов и анализов, ориентированных на роль иммунной системы в различных биологических контекстах.
