Наша лаборатория использует доклиническую ультразвуковую визуализацию для изучения биомеханики сердечно-сосудистой системы при различных заболеваниях и физиологических состояниях. Мы также используем масс-спектрометрическую визуализацию для изучения пространственного распределения липидов в сердечно-сосудистой и мозговой тканях. Мы пытаемся увидеть, где в тканях происходят функциональные и молекулярные изменения.
Хотя обычные методы молекулярной визуализации, такие как гистология и иммуногистохимия, могут дать молекулярные данные, они ограничены доступными в настоящее время красителями и антителами. С другой стороны, масс-спектрометрическая визуализация является нецелевым подходом к мультиомным исследованиям, который при этом сохраняет пространственную целостность ткани. С помощью нашего метода мы можем расширить мультиомику, включив в нее липиды, гликаны и пептиды, и соединить их с методами функциональной визуализации, такими как ультразвук.
С помощью этих методов исследователи теперь могут сочетать функциональную визуализацию с методами молекулярной визуализации. В нашей лаборатории есть две основные области для сердечно-сосудистых заболеваний, и одна из них — ремоделирование сердца с сердечными приступами или лечением рака, то есть кардиотоксичностью. И наша вторая большая цель в области сердечно-сосудистой системы — это изучение старения и того, как старение влияет на сосудистую систему.
Чтобы выполнить четырехмерное ультразвуковое исследование сердца, поместите мышь в положение лежа на спине на пластине для визуализации. Затем поместите преобразователь в держатель в полузаблокированное положение. Совместите выпуклую точку на преобразователе с синей точкой на экране, расположив ее ближе к правой стороне мыши.
Поверните датчик так, чтобы он был выровнен по сагиттальной плоскости мыши так, чтобы выемка была направлена каудально. Нанесите обильное количество геля для ультразвука на вентральную поверхность грудной полости для акустического соединения с датчиком. Опустите датчик до тех пор, пока он не соприкоснется с гелем для ультразвука.
Выполняйте точную регулировку с помощью ручек XY в основании пластины для тонкой настройки. Затем убедитесь, что перистернальный вид по длинной оси на экране включает верхушку, выходной тракт левого желудочка и аорту, выровненные горизонтально для точной визуализации. Выберите «Имя изображения» в нижнем углу экрана, чтобы сохранить изображение в текущей серии.
Поверните преобразователь на 90 градусов по часовой стрелке, чтобы получить периферийный вид по короткой оси. Убедитесь, что левый желудочек четко очерчен на изображении и видны папиллярные мышцы. Выберите значок куба в левом верхнем углу экрана, чтобы настроить четырехмерное изображение.
После сброса датчика отрегулируйте начальное положение чуть ниже вершины, а стоп-положение — до дуги аорты. Установите размер шага от 0,08 до 0,13 миллиметра и частоту кадров от 200 до 300 герц. Перед началом сканирования убедитесь, что жизненно важные показатели и сигнал ЭКГ остаются стабильными.
После завершения сканирования и обработки включите функции «Сохранить данные EKV/4D» и «Стробирование дыхания» для постобработки. Выберите «Имя изображения» в правом нижнем углу и укажите идентификатор мыши в имени. Чтобы визуализировать каждую плоскость обзора в течение сердечного цикла, выберите «Дополнительные элементы управления» и выберите «Загрузить в четырехмерное измерение».
Рассмотрите каждый вид сердца в плоскости, убедившись, что центр сердца остается стабильным на протяжении всего сердечного цикла. Для начала подготовьте лодочки из алюминиевой фольги для мгновенной заморозки мышиных тканей. С помощью щипцов наложите тент на кожу усыпленной мыши и разрежьте надетую кожу ножницами над шеей для сосудистого доступа или чуть ниже грудины для сердечного доступа.
Продолжайте разрезать кожу и мышечные слои, чтобы обнажить сосудистую систему. Для удаления сердца разрежьте кость, чтобы обнажить сердце. С помощью тупого рассечения ватными тампонами изолируйте сердце или сосудистую сеть от окружающих тканей, в том числе от жира.
Осторожно отделите сонный сосуд от нерва. Затем удалите сердце или сосудистую сеть с помощью хирургических инструментов. Поместите сонную артерию, сердце и сосудистую сеть на предварительно маркированную лодочку из алюминиевой фольги.
Затем поместите лодочки в жидкий азот для мгновенной заморозки. Для начала наполните стакан водой ВЭЖХ и отложите его в сторону вместе со шприцами объемом пять и один миллилитров. Затем установите температуру криостата на отметку минус 25 градусов по Цельсию и вставьте лезвие.
Поместите пару щипцов в камеру криостата, чтобы охладить перед установкой ткани. Наберите в шприц пять миллилитров воды ВЭЖХ и поместите ее в криостат, чтобы вода частично замерзла. Прежде чем вода в шприце полностью замерзнет, выложите ее на металлический патрон и дайте ей полностью замерзнуть.
Теперь наполните одномиллилитровый шприц водой ВЭЖХ и поместите его в криостат. Через 30-60 секунд нанесите небольшую мазку частично застывшей воды на центр патрона. С помощью щипцов быстро поместите извлеченное мышиное сердце в каплю воды и удерживайте его там до тех пор, пока окружающая вода полностью не замерзнет.
Для начала достаньте предметное стекло с установленным сердцем мыши из морозильной камеры и поместите его в эксикатор для просушки. Включите распылитель HTX M3+. Откройте приложение HTX на ноутбуке и в разделе «Метод» установите температуру сопла на 75 градусов по Цельсию, скорость потока на 100 микролитров в минуту и давление на 10 фунтов на квадратный дюйм.
Запишите название образца, полярность, матрицу, растворитель и концентрацию в лабораторном блокноте. Затем рассчитайте количество матрицы, необходимое для желаемой концентрации. Далее взвесьте нужное количество 2,5-дигидроксибензойной кислоты для матрицы положительной моды.
Растворите матрицу в 70%-ном метаноле в 15-миллилитровой тубе. Облучайте матричный раствор ультразвуком в течение 10 минут. Во время ультразвуковой обработки снимите предметное стекло с эксикатора.
Откройте лоток распылителя. Затем поместите слайд в левый нижний угол и заклейте края скотчем. Выберите область распыления образца и закройте лоток.
С помощью шприца и фильтра наберите матричный раствор в шприц. Отфильтруйте матричный раствор через шприц в флакон с черной крышкой, расположенный с левой стороны распылителя. Поместите флакон обратно на отведенное место на распылителе и надежно вставьте трубку линии D в флакон.
Затем включите инертный газ и убедитесь, что манометр на распылителе показывает 10 фунтов на квадратный дюйм. Нажмите «Старт» и, как только распылитель достигнет заданной температуры, выберите мигающую кнопку «Пуск», чтобы начать распыление. После завершения распыления извлеките образец из распылителя и поместите его в держатель предметного стекла MALDI.
Отсканируйте держатель слайда MALDI и слайд с помощью сканера. Сохраните изображение на флэш-накопителе для использования с масс-спектрометрической визуализацией. Выберите опцию «Промывка» на распылителе и переместите линию D от матричного флакона к стакану для отходов.
Наконец, распылите метанол на поддон распылителя и протрите его. Отключите азот. С помощью масс-спектрометрии MALDI инфарктированной ткани миокарда была идентифицирована масса молекулярных ионов до заряда 577,52, что, вероятно, соответствует COHb в C или D, что предполагает участие в ремоделировании миокарда.
Четырехмерное ультразвуковое изображение показало области миокарда с площадью деформации менее 20%, визуализированные в виде зелено-желтой ткани, указывающей на зоны инфаркта. При съемке ткани инфаркта миокарда по длинной оси была видна делокализация липидов, что осложняло корреляцию между биомеханикой тканей и молекулярным составом.
