Globale Genexpressionsanalyse Mit einem Zebrafisch Oligonukleotid-Microarray-Plattform

Gene Microarrays sind mächtige Werkzeuge in Genexpressions-Profiling bei einer genomweiten Ebene. Diese Technologie findet Anwendung in einer Vielzahl von biologischen Disziplinen Entwicklungsbiologie und Toxikologie. In diesem Video-, Detail haben wir ein Protokoll für die globale Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Oligonukleotid-Microarray-Plattform für die Zebrafisch.

Gene Microarray-Technologie erlaubt die quantitative Messung und Genexpressions-Profiling von Transkripten auf einer genomweiten Basis. Gene Microarray-Technologie wird in zahlreichen biologischen Disziplinen in einer Vielzahl von Anwendungen, darunter globale Genexpressionsanalyse in Bezug auf Entwicklungsstadium, einer Krankheit Zustand verwendet, und in toxischen Reaktionen. Hierin sind wir eine Demonstration der globalen Genexpressionsanalyse mit einem umfassenden Zebrafisch-spezifischen Oligonukleotid-Microarray-Plattform. Der Zebrafisch Ausdruck Microarray-Plattform enthält 385.000 Sonden, 60 Basenpaaren Länge, verhören 37.157 Ziele mit bis zu 12 Sonden pro Target. Für diese Plattform wurden alle cDNA und genomischer Informationen für die Zebrafisch aus verschiedenen genomischen Datenbanken einschließlich Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC gesammelt ( http://genome.ucsc.edu) und ZFIN (http://www.zfin.org). Als Ergebnis dieses Ausdrucks-Array bietet eine vollständige Abdeckung des aktuellen Zebrafisch Transkriptom. Der Zebrafisch Ausdruck Microarray wurde von Roche NimbleGen (Madison, WI) gedruckt. Diese technische Demonstration umfasst die Fluoreszenzmarkierung der cDNA-Produkt, die Hybridisierung der markierten cDNA-Produkt an den Microarray-Plattform und Array-Scanning für die Signalerfassung mit dem eine Farbe Analyse-Strategie.

Teil 1: Fluoreszenzmarkierung von cDNA

Der Cy3-Farbstoff in der Microarray-Experiment verwendet wird sensibel auf Foto-Abbau. Das Verfahren soll in einer minimalen Menge an Licht zu nehmen. Die Kennzeichnung Protokoll wurde von der BioPrime Array-CGH Genomic Labeling System Manual ¹ angepasst.

1. Die Reagenzien für die Kennzeichnung Reaktion bei -20 ° C gelagert Von der BioPrime Array-CGH Genomic Labeling System Tauwetter 2.5X Random Primer Buffer, 10X dCTP-Mix und Nukle.......

Viele Microarray-Protokolle, darunter auch die hier detailliert, verwenden fluoreszierende Farbstoffe als ein Mittel zur Messung und Quantifizierung Hybridisierung. Die Cy3 Fluoreszenzfarbstoff ist empfindlich auf ein Foto, und Ozonabbau. Es wird empfohlen, dass das Verfahren in minimal-Beleuchtung durchgeführt werden. Darüber hinaus können kleine Staubpartikel mit Hybridisierung und Scannen stören. Besondere Aufmerksamkeit sollte sicherstellen, dass die Arbeit ist sauber und frei von Staub sein.