Analisi di espressione genica globale Utilizzando un Zebrafish piattaforma Microarray oligonucleotidi

Microarray gene sono strumenti potenti in profili di espressione genica a livello di genoma. Questa tecnologia ha applicazioni in una varietà di discipline biologiche tra cui la biologia dello sviluppo e tossicologia. In questo video, abbiamo dettaglio un protocollo per l'analisi globale dell'espressione genica utilizzando una completa piattaforma microarray di oligonucleotidi per il pesce zebra.

Gene microarray tecnologia permette la misurazione quantitativa e profili di espressione genica dei livelli di trascrizione su un genoma base. Gene microarray tecnologia è utilizzata in numerose discipline biologiche in una varietà di applicazioni, tra cui analisi globale dell'espressione genica in relazione alla fase di sviluppo, ad uno stato di malattia, e nelle risposte tossici. Qui, ci sono una dimostrazione di analisi globale dell'espressione genica utilizzando una completa zebrafish specifica piattaforma microarray di oligonucleotidi. La piattaforma microarray di espressione zebrafish contiene 385.000 sonde, 60 paia di basi di lunghezza, interrogando 37.157 con target fino a 12 sonde per ogni destinazione. Per questa piattaforma, tutte le informazioni cDNA e genomiche disponibili per il pesce zebra è stato raccolto da banche dati genomiche diverse tra cui Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu), e ZFIN (http://www.zfin.org). Di conseguenza questo array espressione fornisce una copertura completa del trascrittoma zebrafish corrente. I microarray di espressione zebrafish è stato stampato da Roche NimbleGen (Madison, WI). Questa dimostrazione tecnica comprende la marcatura fluorescente di un prodotto di cDNA, l'ibridazione del prodotto etichettato cDNA alla piattaforma microarray e la scansione di array per l'acquisizione del segnale utilizzando la strategia di analisi del colore.

Parte 1: marcatura fluorescente di cDNA

Il Cy3 colorante utilizzato nell'esperimento microarray è sensibile alla fotodegradazione. La procedura dovrebbe svolgersi in una minima quantità di luce. Il protocollo di etichettatura è stato adattato dalla BioPrime sistema di etichettatura CGH Array Genomic manuale ^1.

1. I reagenti per la reazione di marcatura sono conservati a -20 ° C. Dal BioPrime CGH Array Buffer Genomic sistema di etichettatura Primer disgelo 2.5X casu.......

Protocolli di microarray molti, compreso quello dettagliato qui, usare tinture fluorescenti come un mezzo per misurare e quantificare l'ibridazione. Il Cy3 colorante fluorescente è sensibile alle foto e degradazione dell'ozono. Si raccomanda che la procedura sia condotta in illuminazione minima. Inoltre, piccole particelle di polvere possono interferire con l'ibridazione e la scansione. Particolare attenzione dovrebbe essere data per assicurarsi che l'area di lavoro è pulito e privo di polvere.