Global Gene Expression analys med en Zebrafish plattform Oligonucleotide microarray

Gene microarrays är kraftfulla verktyg i genuttryck profilering vid ett genomet-nivå. Denna teknik har ansökan i en mängd biologiska discipliner, inbegripet utvecklingsbiologi och toxikologi. I den här videon detalj vi ett protokoll för globala genuttryck analys med en omfattande plattform oligonukleotid microarray för zebrafisk.

Gene microarray-tekniken möjliggör kvantitativ mätning och genuttryck profilering av avskrift nivåer på arvsmassan-nivå. Gene microarray-tekniken används i ett flertal biologiska discipliner i en mängd olika tillämpningar inklusive globala genuttrycksanalys i förhållande till utvecklingsstadiet, till ett sjukdomstillstånd, och i toxiska reaktioner. Häri, inkluderar vi en demonstration av globala genuttryck analys med ett omfattande zebrafisk-specifik plattform oligonukleotid microarray. Den zebrafisk uttrycket microarray-plattform innehåller 385 tusen sonder, 60 baspar i längd, förhör 37.157 mål med upp till 12 givare per mål. För denna plattform, var cDNA och genetisk information tillgänglig för zebrafisk som samlas in från olika genomiska databaser, inklusive Ensembl (http://www.ensembl.org), Vega (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC ( http://genome.ucsc.edu) och ZFIN (http://www.zfin.org). Som en följd av detta uttryck rad ger fullständig täckning av den aktuella zebrafisk transkriptom. Den zebrafisk uttrycket microarray trycktes av Roche NimbleGen (Madison, WI). Denna tekniska demonstrationen omfattar fluorescerande märkningen av ett cDNA produkt, hybridisering av de märkta cDNA produkten till microarray plattform, och utbud söker efter signal förvärv med en strategi färganalys.

Del 1: fluorescerande märkning av cDNA

Den Cy3 färgämne som används i microarray experiment är känslig för foto-nedbrytning. Förfarandet bör ske i en minimal mängd ljus. Märkningen protokoll var anpassad från BioPrime Array CGH Genomic märkningssystem Manuell ^1.

1. Reagenserna för märkning reaktionen lagras vid -20 ° C. Från BioPrime Array CGH Genomic märkningssystem tina 2,5 X Slump Primer buffert, 10X dCTP mix, och nukleasfritt vatten. Även Tina Cy3-dC.......

Många microarray protokoll, inklusive en detaljerad här, använda fluorescerande färger som ett sätt att mäta och kvantifiera hybridisering. Den Cy3 fluorescerande färg är känslig för foto och ozon nedbrytning. Det rekommenderas att förfarandet genomföras på minimal belysning. Dessutom kan små dammpartiklar störa hybridisering och skanning. Särskild uppmärksamhet bör ägnas åt att se till att arbetsområdet är rent och fritt från damm.

Det finns många alternativ till mä.......