Behandling af insektben til fluorescensmikroskopi: En metode til at bevare neuromuskulære strukturer til billeddannelse

Protocol

Denne protokol er et uddrag fra Guan et al.,Visualize Drosophila Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle, J. Vis. Exp. (2018).

1. Ben dissektion og fiksering

1. Tag en glas multi-well plade og fyld passende antal brønde med 70% ethanol. Tilsæt 15-20 CO_2-bedøvedefluer (af begge køn og enhver alder) til hver brønd og ved hjælp af en børste, dup forsigtigt fluerne ind i ethanolopløsningen, indtil fluerne er helt nedsænket.
   BEMÆRK: Dette trin er at fjerne neglebåndets hydrofobitet. Vask ikke i mere end 1 minut, fordi dette øger auto-fluorescens af neglebåndet.
2. Skyl fluerne 3 gange med 0,3% nonionisk overfladeaktivt vaskemiddelopløsning i 1x fosfat buffered saltvand (PBS). Hold fluerne i denne opløsning i mindst 10 minutter.
   BEMÆRK: Benene er bedre fastgjort, når de inkluderer vaskemiddel, hvilket sandsynligvis vil øge indtrængen af fikseringsmidlet inde i benet.
3. Placer en multi-well plade på isen sammen med et rør på 4% paraformaldehyd (PFA).
   BEMÆRK: Forberedelsen af frisk 4% PFA fra en 16% PFA ethanolfri lagerløsning er kritisk.
4. Brug pincet til at fjerne fluernes hoved og underliv uden at beskadige brystsegmentet eller benene.
   BEMÆRK: Fjernelse af maven gør det lettere at holde fluen og dissekere benene.
5. Disseker benene fra brystsegmentet med pincet og læg benene i brøndene, der indeholder 4% PFA. Til dette skal du skubbe forsigtigt, men fast ved coxa-thorax krydset ved hjælp af spidsen af fine pincet, indtil benet løsner sig.
6. Fastgør benene i 4% PFA natten over ved 4 °C (ca. 20 timer i alt).
7. Vask benene med 0,3% nonionisk overfladeaktivt vaskemiddelopløsning i 1x PBS, 5x i 20 min hver.
8. Udskift vaskebufferen med monteringsmedium. Hold benet i monteringsmedium i mindst en dag før montering for at give mulighed for dets fuldstændige indtrængning i benet.
   BEMÆRK: Hvis monteringsmediet er meget tyktflydende, fortyndes monteringsmediet til 80% med 1x PBS, fordi den pludselige ændring i viskositet kan få neglebåndet til at kollapse og beskadige benets overordnede struktur. Afhængigt af Gal4-føreren kan fluer bevares i 1 til 3 uger ved 4 °C i monteringsmedier indtil montering.

2. Benmontering

1. Der anbringes ca. 20 μL 70% glycerol i venstre side af et mikroskop og dæksel med kvadratisk 22 x 22 mm² coverslip (Figur 1A,B). Pipette ca. 10 μL monteringsmedium langs en linje parallelt med og i en lille afstand fra højre kant af denne coverlip. Der tilsættes yderligere 30 μL monteringsmedium længere i højre side af diaset (figur 1C).
   BEMÆRK: Ved påføring af en coverlip over benene (se nedenfor) vil monteringsmediet forsigtigt spredes under coverlipet og rundt om benene uden at fortrænge dem.
2. Brug fine pincet løfte benet fra opløsningen og forsigtigt sætte det på montering medium nær venstre coverlip. Gør det samme for hvert ben, og juster dem fra top til bund (Figur 1D).
   1. Løft og overfør benene i en dråbe medium holdt mellem begge spidser af pincet. Orientere benene på to måder: udvendig side op eller ned.
3. Når alle ben (op til 6-8 ben kan monteres) er korrekt justeret, sætte en anden coverslip over benene, således at denne coverslip hviler lidt på den tidligere placerede coverslip Figur 1E for at give plads mellem coverlip og væv og for at forhindre benene i at blive beskadiget (Figur 1G).
   BEMÆRK: Alternativt kan du bruge klistermærkebrønde eller ortodontisk voks til at skabe plads mellem coverlip og diaset.
4. Brug en neglelak til at sikre placeringen af coverlips på hvert hjørne(Figur 1F).
   BEMÆRK: Vævet er nu klar til at blive afbildet.

Results

Figur 1: Procedure for montering af ben på mikroskopdias. Klik her for at se en større version af dette tal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium