Parning och ägg iscensättning: En metod för att generera embryon och sortera dem efter utvecklingsstadium

Protocol

1. Generera embryon genom naturlig parning

1. Kulturembryon till 3 månaders ålder, reproduktiv mognad.
2. Segregera vuxna manliga och kvinnliga fiskar från önskad stam i uppdelade parningstankar på kvällen före embryosamling och tillsätt 2 män och 3 honor till varje tank.
   OBS:Användning av den transgena insulin2a:mCherry fluorescerande reporter stam tillät analys av bukspottskörteln β-celler.
3. Överför fisk till parningstanken med färskt systemvatten och ta bort avdelaren omedelbart efter att lamporna tänds följande morgon.
4. Låt fisken para sig naturligt tills embryon observeras i bottentanken. Samla embryon i 30 minuters intervall tills önskad mängd samlas in. Förvara varje samlad tidspunkt i separata petriskålar i embryomedia vid 28,5 °C.
5. Utför mikroinjektion av genetiskt material eller placering i experimentella odlingsmedier, om så önskas, och odla embryona i färskt Hanks embryomedium i 10 cm Petri-rätter vid 28,5 °C.
   OBS:För genuttrycksanalys hos injicerade eller muterade djur med morpholino (MO) kan varje manipulering ha tillfälliga effekter på genuttrycket. Mutanter kan uppvisa genetisk kompensation på transkriptionsnivå som inte observeras av MO-baserad geninriktning.

2. Embryon i etapper

1. Kultur embryona i grupper om 50–75 embryon per 10 cm Petri-maträtt för att främja konsekvent utvecklingstidpunkt för alla embryon.
2. Övervaka utvecklingsmorfologin med hjälp av dissekerande mikroskop vid blastomere- och somitstadier för att säkerställa utvecklingsprogression.
   OBS:Ta bort döende eller missbildade embryon för att förhindra utvecklingsfördröjning i skålen.
3. Separera embryona baserat på utvecklingsåldern. Arrangera embryona och larverna med hjälp av total kroppslängd efter 24 hkf.
   OBS:Somiterna är den chevronformade mesodermala vävnaden som finns på embryots dorsala del.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:mCherry	ZIRC	ZL1483
Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set	Aquaneering	ZHCT100
Dissecting Microscope	Zeiss