Zebrafish Optogenetics: Aktivere genetisk modifisert somatosensorisk neuron for å studere larval atferdsresponser

Protocol

1. Mount Larver for atferdseksperimenter

1. Lag 1,5% lav smelte agarose i ddH2O og oppbevar i en 42 ° C varmeblokk for å forhindre at den størkner.
2. Bruk en pasteurpipette i glass, og overfør en av de forhåndsskjermede larvene til et rør med 1,5% lav smelte agarose med så lite blått / embryovann som mulig.
3. Overfør larver i en dråpe agarose på en liten Petri-tallerken.
4. Under et dissekerende mikroskop, plasser larve dorsal opp.
5. Når agarose har størknet, kutt bort agarose med et tynt barberblad (#11 skalpell), og la en kile av agar rundt hele larven.
6. Lag to diagonale kutt på hver side av eggeplommen; pass på at du ikke stjeler larven.
7. Fyll området rundt agarose med embryo/blått vann.
8. Trekk agarose bort fra stammen og halen av larven (Figur 1).

2 . Klargjøre høyhastighetsprogramvare for kamera og bildebehandling

1. Monter høyhastighetskamera på dissekeringsområdet.
2. Koble kameraet til datamaskinen.
3. Slå på datamaskinen.
4. Slå på høyhastighetskamera.
5. Åpne video/ bildebehandlingsprogramvare (Vi bruker AOS-bildebehandlingsprogramvare og vil beskrive prosedyrer for å bruke den her, men annen bildebehandlingsprogramvare er like akseptabel).
6. Juster kamerainnstillingene tilsvarende(dvs. 1000 bilder per sekund (fps), 50 % utløserbuffer eller andre foretrukne innstillinger).
7. Start innspillingen.

3. Aktiver enkle nevroner ved hjelp av en 473 nm laser

1. Fest stimulator, laser og optisk kabel.
2. Slå på stimulatoren.
3. Sett stimulatoren til maksimalt 5 volt og en pulsvarighet på 5 ms.
4. Slå på laser i henhold til produsentens instruksjoner.
5. Bruk et dissekeringsmikroskop til å plassere spissen av den optiske kabelen nær cellekroppen til et nevron med ChEF-tdTomato-uttrykk (figur 1).
6. Lever puls av blått lys for å aktivere sensorisk nevron.
7. Ta opp virkemåten ved hjelp av et høyhastighetskamera satt til 500 eller 1000 bilder per sekund.
8. Gjenta eksperimentet etter ønske, vent 1 min mellom hver aktivering for å unngå habituation. (Vi registrerer minst tre svar for hver nevron).
9. For å frigjøre larver, pry fra hverandre oppsto med tang, pass på å ikke skade dyret. Dette dyret kan få lov til å utvikle seg videre, og prosedyren kan gjentas på et eldre stadium for å karakterisere utviklingen av oppførselen. Embryoet kan også monteres på nytt for høyoppløselig konføling av den aktiverte cellen for å korrelere oppførsel med cellulær struktur, som beskrevet nedenfor.
10. Overfør larve til kulturplate med friskt blått / embryovann. Vi bruker en 24-brønns plate for å holde oversikt over individuelle larver.

Results

Figur 1. Diagram over en montert sebrafisk larve og representative nevroner involvert i larval touch response. Sebrafisk larver ble delvis montert i 1,5% lav smelte agarose (representert av stiplede linjer rundt rostraldelen av larven). En trigeminal neuron (i hodet) og en Rohon-Beard neuron (i bagasjerommet) er avbildet i rødt. Mauthner celler er skissert av stiplede linjer i larven. Den optiske kabelen (hvit) vises pla...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Low Melt agarose	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100x15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent