Øyelinse disseksjon: En teknikk for å observere sebrafisklinsemorfologi

Protocol

1. Disseksjon av Larval og voksen sebrafisk linser

1. Bedøv fisk fra 6 dpf larver til voksen alder med trikain til ikke-responsiv til berøring, men viser fortsatt en sterk hjerterytme. Mål fiskens standardlengde i henhold til Schilling (2002) for iscenesettelse.
2. Slukk umiddelbart øynene ved hjelp av mikro-disseksjonssaks og legg dem i en disseksjonsfat i PBS (Figur 1 vist for voksne øyne).
   1. Lag en tilpasset 35 mm tallerken fylt med silikon for linse disseksjoner. Når silikonet er satt, sluker du en divot rundt 2-3 mm i diameter og 0,5 mm dyp for immobilisering av voksne øyne/linser under disseksjonen.
3. Disseksjon av voksne sebrafisklinser
   1. Plasser et voksent øye i parabolen divot posterior side opp fylt med PBS. Immobiliser øyet ved å sette inn tang i <45° vinkel gjennom den optiske platen. Pass på at du ikke hakker eller komprimerer objektivet. Lag to eller tre radiale snitt gjennom netthinnen og sclera fra den optiske platen til ciliary sonen med disseksjon saks.
   2. Skrell tilbake netthinnen og sclera som blomsterblader og snu øyet, hornhinnen side opp. Immobiliser linsen indirekte via manipulering av sclera og hornhinne med den flate siden av saksen, mens du trekker bort netthinnen og festet vev med tang. Trim forsiktig overflødig vev fra linsen.
      MERK: Det er viktig å dissekere nøye for å oppnå konsekvent sunne linser.
4. Disseksjon av larval sebrafisk linser
   1. Plasser en larval øye posterior side opp på den flate delen av silikon parabolen fylt med PBS og bruk en skjerpet wolfram nål for å gjøre radial kutt gjennom netthinnen og sclera mens immobilisere øyet med en annen wolfram nål eller tang.
      MERK: Pass på at du ikke skader objektivet.
      1. Slip spissen av en 2 cm lengde på 0,1 mm wolframtråd elektrolytisk ved å suspendere ledningsspissen i 10% (w / v) NaOH og bruke en lavspennings vekselstrøm14. Fest nålen i en Pasteur pipette ved å smelte glassenden ved hjelp av en Bunsen brenner.
         MERK: Alternative fine disseksjonsverktøy kan også brukes.
         FORSIKTIG: NaOH er etsende.
   2. Øs forsiktig ut linsen fra det dissosierte øyet med en stump side av nålen, og trekk forsiktig bort festet vev.

Results

Figur 1: Sebrafisklinse disseksjon. (A) Øyne dissekeres fra bedøvet fisk og plasseres bakre side opp (B). (C) Øyne immobiliseres av tang via optisk plate (od) og to til tre radiale snitt er laget i netthinnen og sclera fra optisk plate til zonules. (D) Brett klaffene ut for å vise linsen. (E) Roter øyet til ansiktet hornhinnen opp, immobilisere linsen indirekte via hornhinnen og trekke bort sclera-netthinnen. (F) Tri...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phosphate buffered saline (PBS)	Fisher Scientific	BP399
Glass bottom microwell dish (35mm Petri dish, 14 mm microwell, #1.5 coverglass)	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 forceps	Dumont & Fils		Keep forceps sharpened
Vannas micro-dissection scissors	Ted Pella Inc	1346	Sharp/sharp straight tips
Confocal microscope	Nikon		Eclipse Ti-E
Sodium Hydroxide beads	Fisher Scientific	S612-3	CAUTION - corrosive/irritating to eyes and skin, target organ - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 respiratory system, corrosive to metals
Disposable Pasteur glass pipets	Fisherbrand	13-678-20A