Intramusculaire (IM) injectie: samengestelde toediening in de dorsale spier van een volwassen zebravis

Protocol

1. Injectie van het DNA-vaccin en elektroporatie

1. Gebruik voor vaccinaties volgens dit protocol gezonde, 6 tot 12 maanden oude volwassen zebravissen. Bewaar de vis in een doorstroomsysteem met een licht/donkercyclus van 14/10 uur, met een maximum van zeven vissen per 1 L water.
2. Bereid een 0,02% 3-aminobenzoëzuur ethylester (tricaïne) oplossing (pH 7) in tankwater voor het verdoven van de vis. Gebruik een Petrischaal van 10 cm of iets dergelijks.
3. Bereid een terugwinningstank voor door een bekerglas van 5 L te vullen met 3 L schoon systeemwater.
4. Bereid een vaccinatievulling voor om de vis tijdens de vaccinatie in een vaste positie te houden. Neem een 5 x 7 cm² stuk van een spons van 2 tot 3 cm dik. Snijd een groef in de spons met een scalpelmes of een scherpe schaar.
   OPMERKING: Dezelfde vaccinatievulling kan in meerdere experimenten worden gebruikt. Desinfecteer de spons tussen de experimenten door deze in 70% ethylalcohol te weken en te laten drogen.
5. Week de spons grondig in het systeemwater en zet de spons op een petrischaal.
6. Snel de vis 24 uur voor de vaccinaties.
7. Verdoof een zebravis door deze op een petrischaaltje met 0,02% tricaïne te leggen. Wacht tot de vis niet reageert op aanrakingsstimulatie en totdat er geen beweging van de kieuwen is. Verdoof een enkele vis tegelijk.
8. Breng met een plastic lepel de verdoofde zebravis over op de natte spons en plaats de ventrale kant van de vis naar beneden in de groef. Zorg er in de juiste positie voor dat de kop en het grootste deel van het lichaam van de vis zich in de groef bevinden en dat de rugvin en de staart uit de groef steken.
9. Plaats de naald onder de microscoop voorzichtig in een hoek van ongeveer 45° dicht bij de rugspier van de zebravis, met behulp van de x- en y-as fijnafstemmingswielen op de micromanipulator.
10. Zoek de kleine plek zonder schubben voor de rugvin, waar het duwen van de naald geen kracht vraagt. Als weerstand wordt gevoeld, probeer dan een aangrenzende plek. Vermijd het verwonden van de wervelkolom, de rugvin of de schubben.
    OPMERKING: Als de naald buigt tijdens het duwen, verkort u de naald iets door deze te snijden.
11. Gebruik de voetschakelaar om de vaccinoplossing geleidelijk in de spier te injecteren. Observeer de injectie door de microscoop: fenolrood is zichtbaar als het het spierweefsel binnenkomt. Pas indien nodig de duur van de pols aan.
    OPMERKING: U kunt ook de pulsinitiatorknop op het voorpaneel van de pneumatische pomp gebruiken voor de injectie. Het gebruik van een voetschakelaar op afstand maakt het echter mogelijk om de andere hand te gebruiken voor het aanpassen van de pulslengte door het 10-draaischijfwiel. Vermijd het injecteren van de oplossing te snel, omdat dit overmatige weefselschade kan veroorzaken. Zorg ervoor dat u geen lucht injecteert.
12. Elektroporate de vis onmiddellijk na de injectie. Zorg ervoor dat de vis nog steeds onder narcose is. Houd de vis op de spons en plaats de vis tussen pincetelektroden, zodat de elektroden zich aan elke kant van de injectieplaats bevinden. Druk het elektrode-pincet niet te strak in, maar houd beide elektroden in contact met de vis.
    1. Druk op de startknop op de elektroporator om zes pulsen van 40 V en 50 ms te geven.
    2. Breng de vis voorzichtig over naar de terugwinningstank.
    3. Reinig de elektroden na elke elektroporatie door ze te vegen met 70% ethanol.
       OPMERKING: Controleer zorgvuldig het welzijn van de vis na de vaccinatie. Euthanaseer elke vis die tekenen van ongemak vertoont (een langzaam herstel van anesthesie, afwijkend zwemmen, snakken) in 0,04% tricaine. Breng de vis na het herstel over naar de doorstroomeenheid en voer hem normaal.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Phenol red sodium salt	Sigma-Aldrich	114537-5G
Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt)	Sigma	A5040-100g	anestesia and euthanasia solution
Tweezertrodes Electrodes (7 mm) Kits	BTX Harvard apparatus	BTX 450165	tweezer type electrodes
Aluminosilicate capillaries	Harvard apparatus	30-0108
Micromanipulator	Narishige	MA-153
Microscope	Olympus	ZS61
ECM Electro Square Porator	BTX Harvard apparatus	BTX ECM 830
Plastic spoon
Sponge
Styrofoam workbench