Hjerte dissektion: En metode til at observere zebrafisk hjerte udvikling

Protocol

1. Måling af fisk og dissektion

1. Placer enkelt fisk i petriskål halvt fyldt med frisk PBS og læg den på sin højre side.
2. Måle længden af fisk fra snude til bund af halen (den kaudale stilk), undtagen halefinner, ved hjælp af en digital mm caliper (figur 1). Dette er standardlængden (SL).
3. Hver fisk kan tildeles en kombination af tal/bogstav, så en enkelt fisk og det resulterende dissekerede hjerte kan spores til senere analyse. Data, herunder forældres lagernummer, alder ved fiksering, SL-målinger, blev indtastet i et regneark og organiseret baseret på disse etiketter.
4. Før dissektion skal du mærke PCR-rørstrimler med tildelt sporingsnummer og fylde med PBT eller anden løsning, der er egnet til yderligere analyse.
5. Orient fisken ventral side op i petriskålen, mens stabilisere kroppen med pincet holde hovedet mellem øjne og gæller(Figur 1).

Mindre fisk (mindre end 12 mm SL):

6. a) Brug skarpe pincet, eller en mikro-nål i en nålholder, fjerne brystmuskler og finner fra kroppen til at afsløre hjertet. Den konstante bevægelse af tang under dissektion kan forårsage strømme i PBT, der flytter fisken. Dette er især problematisk for mindre fisk, således en mikro-nål kan bruges til at fjerne brystmuskler og finner og åbne kroppen hulrum.
7. a) Brug forsigtigt tangen til at skovle hjertet ud af hulrummet under atriet. Alternativt kan du i nogle fisk være i stand til at fjerne hjertet ved forsigtigt at trække pæreformet ud, og resten af hjertet vil følge. Vær forsigtig med placeringen af atriet, hvis du bruger denne teknik, da det let kan beskadiges. Hvis der er ekstra væv, der kommer med hjertet, det er fint og kan ryddes efter.
8. a) Hvis fisken indeholder en fluorescerende hjertemarkør som Tg(myl7:GFP)^twu34, skal der anvendes fluorescerende muligheder for dissektion og kontrol af, at hjertet fjernes ved lysstof (figur 2).
9. a) Når hjertet er fjernet fra hulrummet, skal du bruge pincet til at holde hjertet og en mikro-nål til at fjerne ekstra ikke-hjertevæv og epicardial foring fra ydersiden af hjertet.

Større fisk (større end 12mm SL):

6. b) Brug fjeder håndteres mikro-saks, gøre tre snit på mindre end 1mm dyb: 1- tværgående skære gennem gællerne 2-tværgående snit på forreste mave 3- sagittal snit på ventral side forbinder begge udskæringer (Figur 3).
7. b) Ved hjælp af skarpe pincet fjernes brystmusklerne og finnerne fra kroppen for at åbne kropshulen og afsløre pericardiumets sølvfarvede væv (Figur 4A). Fjern dette pericardiale væv, og hjertet bliver synligt (Figur 4B).
8. b) Brug mikro-saks til at skære arterien forbundet til pæreformet arteriosus, placeret overlegen i hjertet. Når denne arterie er skåret, sætte pincet tips under atrium, skal du bruge pincet til scoop hjertet ud af hulrummet. Hvis der er ekstra væv, der kommer med hjertet, det er fint og kan fjernes senere.
9. b) Når hjertet er fjernet fra hulrummet, skal du bruge de to pincet til at holde hjertet og fjerne ekstra væv, eller et par pincet til at holde hjertet og en mikro-nål til at fjerne ekstra, ikke-hjertevæv. Den epicardial foring, tydeligt ved sin sorte pigmentering, kan fjernes fra ydersiden af hjertet, hvis det ønskes ved forsigtigt at skrabe vævet.

Results

Figur 1. Hold fisken med pincet mellem øjne og gæller.

Figur 2. En hjertespecifik fluorescerende transgen markør som Tg(myl7: GFP)^twu34, vist her, kan hjælpe med at visualisere hjerter dissekeret fra mindre fisk.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Forceps #55	Fine Science Tools	11295-51
Micro-scissors	Fine Science Tools	15005-08
Pin holder	Fine Science Tools	26016-12
Micro-needles	Fine Science Tools	10130-10
Petri dishes	BD Biosciences	351029