超声引导下显微注射到小鼠前脑在子宫内在E9.5

Summary

小鼠的存活在宫内手术，可在开发过程中基因表达的分子操纵。在这里，我们描述了使用高频率的超声波成像引导逆转录病毒载体注射到鼠脑在胚胎一天（五）9.5。

Abstract

小鼠的存活在宫内手术，可在开发过程中基因表达的分子操纵。然而，由于子宫壁是不透明的，在早期胚胎发育，极大地限制的能力为目标的特定部位的显微注射胚胎。幸运的是，高频率的超声波成像许可证生成可用于实时图像引导胚胎地区利益的一个显微注射针。在这里，我们描述了利用这种成像引导胚胎一天鼠标的前脑的脑室系统（E）9.5逆转录病毒载体注射。这个方法使用一个允许访问的子宫角，和一个特别设计的板，允许主机的胚胎，而他们的成像和注射生理盐水中沐浴的剖腹探查。成功的手术，往往会造成大部分或全部注入的胚胎存活到任何利益随后的时间点（embryonically或产后）。这里所描述的原则，可以稍作修改用于执行注射到E8.5胚胎羊水（从而允许尚未闭合的神经管，后沿前程度的感染），或进入脑室系统大脑在E10.5/11.5。此外，在中期源性年龄（〜E13.5），超声显像可用于直接注射到病毒感染或细胞移植特定的大脑区域。使用超声显像在小鼠子宫内注射，以指导是一个非常强大的技术许可证，否则将异常艰难，如果不是不可能的方式操纵分子和细胞的小鼠胚胎。

Protocol

第1部分。准备手术区

1. 如果与生物危险性试剂（如逆转录病毒载体）的工作，手术应进行第二生物安全柜（BSC）内。超声背向散射显微镜（UBM）应坐在旁边的BSC，与换能器内的BSC，并在举行一个特别设计的手术阶段由电机控制支持。建构在视频显示的阶段所需的组件列上线。这份清单，连同阶段的图像，从多个角度（应要求提供），应允许建设。
2. 开腹的开放和关闭（在腹腔被剖开，以允许访问内部器官的外科手术）通常是塑料底板的吸水垫。手术前的所有必要的工具（如剃须刀，手术剪，钳，装载autoclip应用方等），材料（如PBS中，缝线，麻醉，鼠标持有者和覆板，等）应进行消毒，并放置在手术区。手术成功的机会最大化，限制切口开放的时间是非常重要的。所有动物的处理应与MB - 10解决方案，或相当于已消毒手套。应进行反复消毒，根据需要，以确保无菌手套。

第2部分。鼠标麻醉

1. 填写与麻醉剂含有1部分戊巴比妥（苯巴比妥50毫克/毫升），4个部分，过滤消毒25毫克/毫升的PBS硫酸镁溶液1毫升注射器。这将导致在一个解决方案，是10毫克/毫升的苯巴比妥和20毫克/毫升硫酸镁。应单独加权每只小鼠注射巴比妥每公斤体重90毫克（例如，一个28 GM鼠标将被注入250μL）。
2. 穿透皮肤和腹部肌肉的腹部怀孕小鼠在胚胎一天（五）9.5（腹腔，IP）（如需要可以使用其他年龄段）注入。允许8-12分钟鼠标无响应。足够的麻醉应确认的动物悠然自得，和缺乏运动尾巴和脚趾捏。轻轻之间的指甲掐住是非常敏感的，缺乏任何如捏的反应，表明动物有足够的麻醉。注意甚至完全反应迟钝，尾部和脚趾捏的动物，可能在最初的手术切口，有时抽搐略有。然而，这是自反的反应，并不表示不足麻醉。应适用于以石油为基础的眼科唇膏鼠标，以避免在手术过程中干燥的眼睛。
3. 手术区和超声波机的设置，而等待的鼠标成为麻醉。由于使用的逆转录病毒或慢病毒需要BSL2以上的病毒注射所述的遏制，应在生物安全II内阁。此外，接触到病毒的所有解决方案和一次性材料应与10％的漂白粉溶液进行消毒。应视为手术工具和超声波设备，杀菌解决方案，如MB - 10 （ http://www.quiplabs.com/mb10.htm），或由有关设施使用等效。

第3部分。暴露的胚胎

1. （取决于给定的动物设施和可用空间的限制）如果可能的话，它是首选手术准备区有一个单独的位置从手术区。这将最大限度地减少动物之间的交叉污染的机会。要启动的手术，它的后面放置到动物无菌吸水的表面，并用70％乙醇冲洗腹部，彻底。可以更广泛的术前治疗（例如，连续两轮优碘和70％乙醇洗涤），但在我们的经验，这是这种类型的啮齿类动物的生存手术没有必要。采用双边缘剃刀，刮脸从腹部面积约1英寸宽，1.5英寸长的头发。使用剃刀短期快速移动，在大约45 °角。重要的是适当治疗，手术区，但不会受到过度湿润，因为这可能导致不必要的令人心寒的动物，甚至可能体温过低。
2. 使用精细的手术剪，先通过皮肤1“纵形切口，然后通过腹部肌肉的动物（切割通过结缔组织的皮肤肌肉，将有助于与第二个切口）。注意，整个过程护理采取保证手术工具保持无菌的，并应根据需要进行治疗用消毒液（即如果该工具提示接触与非STE激怒材料）。
3. 使用镊子小心吸取子宫角，并记录每边的胚胎数量。同时留下两个相邻的胚胎暴露（选择其中两个将取决于每边的配置），子宫角到动物。在此背景下，两个胚胎将被暴露在某一特定时间和沐浴用PBS，而她的母亲仍然在她的背上。
4. 放入有机玻璃持有人的动物在它的后面，将手术过程中（Figure1A）*.下一步，降低10厘米组织培养皿**（应消毒，使用的MB - 10前）在母亲，对通过绿色硅橡胶膜（使用L RTV硅橡胶基地，并略有放置一个镊子固化剂;陶氏康宁公司的产品编号分别为3142761和2156946）。正如你降低动物板，使用镊子夹住要注入的两个胚胎在子宫组织，并通过膜轻轻一拉。与此同时，该板块下调到持有人完全放下，图钉推举行的地方。预热（至37 ° C），然后加入PBS是菜完全覆盖的胚胎。
5. 将下Figure1A）创建通过暴露的胚胎在子宫壁上（Figure1B）实时成像的超声探头（含动物和暴露的胚胎注射阶段。然后探头降低到PBS浴（使用机动控制）直接对胚胎进行成像。图片可当探头远离胚胎约2-3毫米。这是非常重要，以确保探头不打胚胎，因为它来回振荡采集图像。

*母亲在手术过程中所掌握的持有人可以很容易地由一个机加工车间。它应包括广泛的有机玻璃基地，有两个有机玻璃双方粘在上面，并在它们之间的空间（足够宽的鼠标，而在它的后面，以适应躺在）。双方应的谷地上，然后填充黑色蜡（例如，从解剖托盘）。这蜡作为融入其中图钉将按下按住板，胚胎沐浴在注射过程中的PBS材料。

**10厘米细菌菜应该有一个洞（约直径2cm）砸出底部中心（这可以用重型便携式打孔和^第一个13/16英寸的圆形模具： http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ）。此外，两方之一的中心孔（约1.5cm的距离）的小孔应与火焰加热的针（或他们可以当然演练）烧毁。真空润滑脂，将持有该板块到持有人的图钉推到黑蜡通过这些小孔，然后覆盖。真空润滑脂，以防止泄漏出来的PBS。

第4部分。装入一个显微注射针的病毒

1. 倒角为1mm（内径）一个时尚显微注射针拉玻璃毛细管。针的清晰度是至关重要的，不够锋利的针，可以严重危及子宫壁的渗透和amnionic囊，可导致实验失败。削尖的针，然后放入吸管持有人，这是通过油管安装手动泵输液/提款（可以使用其他设备来调节的装载和放电针，但是这就是25μLmicrosyringe连接在视频显示）。最佳的响应（以避免空气中弥漫系统的扩展和压缩），microsyringe，管，针头应填写与矿物油。
2. 装货前针，确保有一路针尖从注射器系统无气泡。然后绘制一个小气泡（1-2毫米长）进针开始之前加载病毒。这气囊有助于保持病毒和矿物油之间的距离。被注入病毒的股票应包含在一个终浓度为0.08毫克/毫升的聚凝胺（病毒生产的更多信息，请参阅参考文献1，2）。注意集中逆转录病毒的股票一般都含有大量的颗粒物，其中包含了大多数的传染性物质，因此不能被过滤掉了没有5 - 10倍滴度下降。另外，根据编制后，病毒的股票可能会裂解包装细胞的基因组DNA（尤其如此，如果使用293细胞生成MLV / VSV的假型病毒）的粘性。如果病毒等分是粘稠的，少量的DNA酶，我可以和应该被添加到放松的股票，或加载中针会是非常困难的。一病毒的股票（8-10μL）液滴应放在一个封口膜无菌针加载准备。然后，使用撤出泵，谨慎地装载针重视，以避免堵塞。加载针放入显微注射区的位置，不小心打破针，对胚胎或超声探头。请注意，如果由于某种原因针注射前发生明显加载，它可以帮助吸引到一角，开始注射前可以出院了少量空气。这个气囊可以防止病毒在针尖（几乎总是呈现，装针无用的发生）干燥的股票。

第5部分。超声引导下的病毒注射液

1. 超声探头的实时图像创建在视频监视器上显示，并可以用来指导胚胎的显微注射针。可以使用这个系统的病毒注入羊膜囊E8.5或羊膜囊或从E9.5 - E11.5（Figure1B）脑室系统。这是程序的最困难的部分，并要求一举手一掌握（5-20​​小时取决于研究者的顺序）的大量经验。针尖在超声图像作为屏幕上的亮点是显而易见的，应按照调整探头位置，使用机动控制在Y和Z平面（移动，并在X手动控制平面）。探头的振荡方向平行的针的长度，这是极为重要的。这将保证针尖保持在运动图像平面位置注入胚胎。
2. 应定位于胚胎，这样的目标区域（在这种情况下，脑脑室）是随时可见，子宫材料量至少在注射路径针。此外，关键是不通过胎盘注入。一旦目标的大脑区域是内衬针进步的方向（使用的显微操纵器上的旋钮），针应只接触子宫壁，然后一个短期的快速申诉委员会提出应渗透组织。类似的方法是用来穿透amnionic囊，然后大脑。在某些情况下，可以打，经验丰富的研究员在一项议案心室，尤其是当针是非常尖锐的。移动探头，针和胚胎（移动舞台上的母亲）的机制，需要动手实践掌握。
3. 一旦所需的胚胎数已注入5.0丝线缝合关闭腹壁。这种类型的手术缝合机制不特定。最后，使用兽医autoclips超过主食皮肤腹部肌肉针。因为鼠标会咀嚼缝线缝合皮肤，不建议。镇痛应适用于切口面积，以减少疼痛的金额，由经验丰富的鼠标，因为它唤醒。这是建议，注入0.25％布比卡因溶液（0.8毫升/公斤，或2毫克/公斤），皮下沿切口部位的每一个几毫米。
4. 当鼠标轻轻复苏奠定吸水纸含有凝胶包（便于饲养和水化）在一个干净的笼子里的动物。笼放置到温暖的一个幻灯片设置在37 ° C，保持体温。惊醒时，放入一个干净的笼子的鼠标和凝胶包，并返回到动物机架。
5. 次日检查鼠标，任何阴道出血，腹部收缩，和/或整体心疼的样子，所有这一切都表明流产。如果是这种情况，立即安乐死的鼠标。头发以及培养和整体健康的外观显示手术成功恢复。注射的胚胎可以牺牲embryonically或出生后，作进一步的分析。如果病毒对记者如人类碱性磷酸酶（PLAP）或GFP基因，染色揭示阳性病毒感染（Figure1C）的地区。

代表性的成果

注射的胚胎可以牺牲后1-2天注射到成年的方式。如果病毒对记者如PLAP或GFP的基因，然后记者表达用来识别病毒感染的细胞和这些细胞的克隆。例如，在图1C所示是一个产后的大脑是在子宫内感染在E9.5与逆转录病毒载体表达PLAP的组织切片。紫色集群组织化学染色后观察感染的细胞。此外，以确定病毒感染的细胞，记者表达允许一个研究细胞的形态和位置，以及基因表达状态。

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图1。病毒注射到E9.5小鼠脑脑室。 A.麻醉动物被放置在注射阶段。两个胚胎会被揭露和定位下指示的位置（箭头）的超声探头。位于附近的胚胎显微注射针充满病毒和内衬超声探头。 B.屏幕捕捉的实时超声图像从E9.5小鼠胚胎。五，心室; AS，羊膜囊，威斯康星大学，子宫壁。 C.胚胎在E10.5 PLAP表达病毒注射。组织化学染色PLAP揭示病毒感染事件的位置。

Discussion

使用超声引导下的病毒注射液可进行E8.5 - E11.5，其中只有羊膜囊，可以在E8.5注射，而两个羊膜囊和脑室系统，可以从E9.5 - E11.5注入。正确执行时，病毒颗粒注入脑室系统使用超声引导下进入脑室系统的上皮细胞，因此，可以感染前脑（大脑皮层，基底节，间脑，眼等），中脑的各种结构和后脑（Figure1C）。注入羊膜囊病毒进入细胞胚胎的外部。除了病毒，还可以用于超声引导下注入到发育中的胚胎细胞。因此，这种技术提供了多种选择，从设计实验时，选择（一段时间的发展，结构，病毒/细胞）。

至关重要的是，注射的病毒或细胞表达病毒/注射细胞易于识别的记者。从历史上看，人类胎盘碱性磷酸酶（PLAP）或GFP已被使用。从以往的经验，我们发现PLAP可以是一个非常有用的报告基因，因为PLAP组织化学和免疫组织化学染色产生一个尖锐而鲜明的单细胞染色，让来分析细胞的形态和位置，并进行克隆分析。由于病毒GFP的表达可以是淡淡的，GFP的记者可能不理想的染色组织，但有用的，如果想获得单个细胞，通过荧光激活细胞分选（FACS）。

Materials