超音波ガイド下のマウスの前脳へのマイクロインジェクション子宮内で E9.5で

Summary

マウスの子宮内生存の手術では 、開発中の遺伝子発現の分子操作を可能にします。ここでは、胎生（E）9.5でのマウスの脳にレトロウイルスベクターの注入を導くために高周波数超音波イメージングの使用を説明しています。

Abstract

マウスの子宮内生存の手術では 、開発中の遺伝子発現の分子操作を可能にします。子宮壁は、初期胚発生の間に不透明であるため、しかし、、マイクロインジェクションのための胚の特定の部分を対象にする機能が大幅に制限されています。幸いにも、高周波数の超音波イメージングでは、関心の胚領域にマイクロインジェクションの針を導くために、リアルタイムで使用できる画像の生成を可能にする。ここでは、胎生（E）9.5でマウスの前脳の脳室系にレトロウイルスベクターの注入を導くためにそのような画像の使用について説明します。このメソッドは、子宮角、そしてそれらを撮影し、注入される間に生理食塩水を浴びれる宿主胚を許可する特別に設計されたプレートへのアクセスを許可するように開腹術を使用しています。成功する手術は、しばしば最もまたは関心の後続の時点（embryonicallyまたは出生後）に生存注入胚のすべてになります。ここで説明する原理は、E8.5胚（それによってはまだ閉じていない神経管の前部後部の範囲に沿って感染を認める）の羊水に、またはの脳室系に注入を行うためにわずかな変更で使用することができますE10.5/11.5で脳。さらに、中期神経年齢層（〜E13.5）で、超音波撮像は、ウイルス感染や細胞移植のための特定の脳領域に直接注入を使用することができます。マウスでは子宮内注射に導くための超音波イメージングの使用は不可能ではない場合そうでない場合は非常に困難な方法で、マウスの胚の分子や細胞の操作を可能にする非常に強力な手法です。

Protocol

パート1。外科領域を準備します。

1. バイオハザード試薬（例えば、レトロウイルスベクター）を扱う場合、手術はバイオセーフティIIキャビネット（BSC）の内部で実行する必要があります。超音波後方散乱顕微鏡（UBM）は、BSC内部のトランスデューサで、BSCの隣に座って、そして特別に設計された外科的ステージ上でのモータ制御のサポートにより、所定の位置に保持する必要があります。ビデオに示されているステージを構築するために必要なコンポーネントは、行に記載されています。このリストは、一緒にいくつかの角度からステージの画像（リクエスト制）で、建設を許可する必要があります。
2. 開腹の開閉（腹腔の内臓へのアクセスを許可するために、オープンカットされている外科手術）は、通常、プラスチック製のバッキングと吸収パッド上で実行されます。手術前に必要なツール（autoclipアプライヤをロードした例剃刀、外科用ハサミ、鉗子、、など）、および材料のすべて（例えばPBS、縫合糸、麻酔、マウスホルダーとを覆うプレート、など）滅菌とに配置されるべきである外科領域。切開が開いている時間の量を制限することで、手術の成功のチャンスを最大化するために重要です。すべての動物の処理は、MB - 10のソリューション、またはそれに相当するとされ、駆除された手袋で実行する必要があります。手袋は滅菌であることを保証するために、必要に応じて繰り返し消毒を実施すべきである。

パート2。マウスの麻酔

1. 1部ネンブタール（50 mg / mlのペントバルビタール）PBSで25 mg / mlの硫酸マグネシウムを滅菌フィルター処理の4つの部分にを含む麻酔液で1 ccシリンジを埋める。これは、10 mg / mlのペントバルビタールおよび20 mg / mlの硫酸マグネシウムであるソリューションになります。各マウスは個別に重み付けし、体重のペントバルビタールkg当り90mgの（例えば28グラムのマウスが250μLを注入される）を注入する必要があります。
2. 皮膚や腹部の筋肉の両方を貫通して（必要に応じて他の年齢層を使用することができます）胎生（E）9.5で、妊娠マウスの腹部（腹腔内、IP）に注入する。マウスの8月12日分が応答しなくなることができます。適切な麻酔は、リラックスした動物の姿勢、および尾とつま先ピンチに応答する運動の欠如によって確認されるべきである。そっと指の爪の間に挟みは、非常に敏感であり、そしてそのようなピンチへの応答の欠如は、動物が十分に麻酔であることを示します。尾とつま先ピンチに完全に応答しなくなる動物は、いくつかの回が最初の外科的切開に反応してわずかにけいれん場合でも注意してください。しかし、これは反射的反応であり、不十分な麻酔を示すものではありません。石油ベースの眼科バームは、手術中に乾燥を避けるために、マウスの眼に適用する必要があります。
3. マウスの麻酔になることを待っている間に外科領域と超音波の機械を設定する。レトロウイルスやレンチウイルスの使用が必要なため、ウイルスの注射上述したようBSL2封じ込めは、バイオセーフティIIの内閣で実行する必要があります。さらに、ウイルスと接触するすべてのソリューションと使い捨ての材料を10％漂白剤溶液で除染する必要があります。手術器具と超音波機器は、MB - 10（のような消毒液で治療されるべきであるhttp://www.quiplabs.com/mb10.htm ）、または、当該施設で使用される同等の。

第3部。胚の曝露

1. 可能な場合（特定の動物施設と利用可能なスペースの制約に応じて）それは外科の領域とは別の場所に手術の準備の面積を有することが好ましい。これは動物の間のクロスコンタミネーションの可能性を最小限に抑えることができます。手術を開始するには、無菌の吸収面に背の上に動物を配置し、70％エタノールで十分に腹部を洗う。より広範な術前の治療は（Betadineの例、連続するラウンドと70％エタノールで洗浄）を採用し、しかし、我々の経験でこれはげっ歯類の生存の手術のこのタイプの必要はありませんすることができます。ダブルエッジのカミソリを使用して、約1インチ幅と1.5インチ長の領域では腹部から毛を剃る。約45 °の角度でカミソリで短く迅速な動きを使用してください。それは外科領域が適切に扱われることが重要であるが、過剰な濡れを受けていない、これは動物の不必要な身も凍るにつながることができるように、そして可能性も低体温。
2. 細かい外科はさみを使用すると、動物（第二切開を助けるの結合組織を切断筋肉に皮膚を保持している）の腹部の筋肉を通して、最初の皮膚を通して1"縦切開を行い、注をそのプロシージャのケアを通じてすべき手術器具の滅菌のまま、およびツールヒントが非ステレオに触れた場合は、必要に応じて消毒剤による治療が行われるべき（すなわちように注意する）材料を波立たせる。
3. 鉗子を使用すると、慎重に子宮角を引き出す、とそれぞれの側の胚の数を記録。 （選択する2つのそれぞれの側の構成に依存するが）公開される2つの隣接した胚を残したまま、戻って動物に子宮角の大部分を置きます。母親が彼女の背中にしたまま、この文脈では、2つの胚が所定の時間にさらされるとPBSに浸し。
4. それは手術中になる、そのバックプレキシガラスのホルダーに（図1a）に動物を配置*次に、緑のシラスティック膜（L RTVシリコーンゴムベースを使用して作られた、とを通じてわずかに置かれたピンセットで、ダウン母親以上（使用前にMB - 10で消毒する必要がある）10cmの組織培養皿**を下げる硬化剤、ダウコーニングの製品番号をそれぞれ3142761と2156946）。あなたが動物を介してプレートを下に下げるように、注入されるには2つの胚の間に子宮組織を把持する鉗子を使用して、そして穏やかに膜を介してそれらを引き出します。それと同時に、プレートをホルダーの上に完全にダウンして低下する、と画鋲が所定の位置に保持するためにプッシュされます。予め温めておいた（37℃）PBSは、完全に胚をカバーするために皿に追加されます。
5. 動物を含有する注射剤の段階を置き、子宮の壁（Figure1B）を通じて公開さ胚のリアルタイムイメージングを作成するために超音波プローブ（図1a）の下で胚を露出。プローブを直接に撮像される胚にわたってPBS浴中に（モーターコントロールを使用して）低下する。プローブは約2〜3 mm離れた胚からの場合に画像を得ることができます。それは画像を収集するために前後に振動するようにプローブヘッドは、胚をヒットしていないことを確認することが非常に重要です。

母親が手術中にかかっ*ホルダーは簡単に機械工場で行うことができます。それは上に接着されたtwoプレキシガラスの側面を持つ幅広いプレキシガラスのベース、そしてそれらの間の空間を（十分な幅がマウスの背中に横たわっている間に収まるように）を含んでいる必要があります。双方は、黒のワックス（解剖トレイからなど）で満たされ、それらの谷のゴロでのアウトを、持つ必要があります。そのワックスは、画鋲が胚を注入中に浴びていることをPBSのプレートを保持するために押さ先となる物質としての役割を果たします。

：** 10センチメートル細菌の料理は、底部の中心からパンチ穴（直径約2センチメートル）（これはヘビーデューティポータブルパンチと16分の13 ^番インチの円形ダイを使ってできることが必要ですhttp://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ）。さらに、中央の穴のいずれかの側（離れて約1.5cm）の2つの小さい穴は、火炎加熱針（またはそれらが当然のドリルを作ることができる）に焼き付いていることがあります。次に、これらのセキュリティホールは、真空グリースで覆われており、ホルダーの上にプレートを保持する画鋲は、黒のワックスに強行場所になります。真空グリースは漏れからPBSを防ぐためです。

パート4。マイクロインジェクションニードルにウイルスをロードする

1. 1mmを（内径）ベベルのファッションマイクロインジェクションの針は、ガラスキャピラリーを引っ張った。針の鋭さが重要であり、十分に鋭い針での作業は、真剣に子宮壁と羊膜嚢の浸透が損なわれる可能性があります、そして実験的な故障につながることができます。シャープ針は、マニュアル注入/撤退ポンプにマウントされている（他のデバイスが針のローディングと放電を調節するために使用することができますが、これは何であるかを25μLをマイクロにチューブを介して接続されたピペットホルダー、に配置され、 ）ビデオに示す。最適な応答性（空気満たされたシステムに関連付けられている拡張と圧縮を避けるため）の場合は、マイクロシリンジ、チューブ、針は鉱物油で埋めなくてはなりません。
2. 前に針を読み込むためには、注射器からシステム内に気泡が針の先端までのすべての方法がないことを確認します。その後、ウイル​​スをロードするために開始する前に針に小さな気泡（長さ1〜2 mm）を引く。このエアポケットは、ウイルスや鉱物油との間の分離を維持するのに役立ちます。注入されるウイルス株は0.08 mg / mlの最終濃度（ウイルス産生の詳細については文献1、2を参照してください）​​にポリブレンが含まれている必要があります。力価の10倍ドロップする - 集中レトロウイルス株は、一般的に感染性物質の大部分が含まれている粒子状物質、かなりの量が含まれている、など5せずに除外することはできないことに注意してください。また、準備に応じて、ウイルスストックは、溶解したパッケージング細胞のゲノムDNA（特に真MLV / VSV偽型ウイルスを生成するために293細胞を使用している場合）から粘性のある可能性があります。ウイルス液の一部は、DNアーゼ少量の粘性が高い場合は、私はとすべき株式を緩めるに追加することができます、またはニードルをロードすることは極めて困難になります。 Aウイルスストック（8-10μL）の液滴が針のロードの準備のためにパラフィルムの滅菌部分に配置する必要があります。その後、撤退のポンプを使用して、慎重に目詰まりを避けるために針払う注意を読み込みます。胚の針、または超音波プローブを壊さないように注意しながら、注入領域のマイクロマニピュレータの位置にロードされた針を置きます。インジェクションが発生することになる前に何らかの理由で針が大幅にロードされている場合、それは注射を開始する前に排出することができる先端、中に少量の空気を描くのに役立つ可能性があることに注意してください。このエアポケットは、針の先端（ほとんどの場合そのロードされた針が使い物になるの発生）での乾燥のウイルス株に対して保護することができます。

第5部。超音波ガイドウイルス注入

1. 超音波プローブによって作成されたリアルタイム画像は、ビデオモニタ上で可視化、および胚にマイクロインジェクションの針を導くために使用することができます。このシステムのウイルスを使用することE8.5またはいずれかの羊膜嚢またはE9.5 - E11.5（Figure1B）から脳室系で羊膜嚢に注入することができます。これは、プロシージャの中で最も難しい部分であり、マスター（捜査官に応じて50〜20時間程度）の経験上の手のかなりの量を必要とします。針の先端が画面上で最も明るいスポットとして超音波画像で明らかである、とyとz平面に電動のコントロールを使用してプローブの位置の調整（準拠で動い見られるべきである、とxの手動制御平面）。それは、プローブの振動方向は、針の長さに平行になることが非常に重要です。これは、針の先端が胚への注入のためにそれを配置するために運動中に、画像面に残っていることが保証されます。
2. 胚は、ターゲット領域が（この場合は前脳脳室で）容易に表示されていると注入経路における子宮材料の少ない針にアクセス可能になるように配置する必要があります。さらに、それは胎盤を介して注入することではないが重要です。ターゲットの脳領域は針の進歩の方向（マイクロマニピュレータのノブを使用して）と並んでされると、針はちょうど子宮壁に触れるはずですし、短い速いジャブは前方に組織に浸透してください。同様のアプローチは、羊膜嚢し、脳に浸透するために使用されます。針が鋭くなっている場合は特にいくつかのケースでは、と経験豊かな研究者は、一つの動きで心室を打つことができます。プローブ、針、そして胚を（ステージ上で母を移動して）移動の力学は、実際にハンズオンマスターする必要があります。
3. 胚の希望数が注入されると、5.0絹縫合糸で腹壁を閉じてください。縫合の力学は、手術のこのタイプに固有のものではありません。最後に、腹部の筋肉に針を介して一緒に主食肌に獣医オートクリップを使用してください。マウスがステッチをかむするので皮膚を縫合することは推奨されません。鎮痛は、それが目覚めて、マウスが経験する苦痛の量を減らすために切開の領域に適用する必要があります。それは皮下ごとに数ミリの切開部位に沿って（0.8 ml / kgを、または2 mg / kg体重）0.25％ブピバカイン液を注入することをお勧めします。
4. マウスが回復しながらゆっくりとゲルのパックを（餌と水和を促進するために）含まれている清潔なケージで吸収紙で動物を置く。体温を維持するために37スライドウォーマーセット° Cの上にケージを置きます。起こされたら、清潔なケージにマウスとジェルパックを配置し、動物のラックに戻ります。
5. 次の日は、中絶を示すすべてがあらゆる膣からの出血、腹部収縮、および/または全体的に困っているように見える、のためにマウスを確認してください。このような場合は、すぐにマウスを安楽死させる。よく整備された髪と全体的な健康な外観は、手術からの正常な回復を示している。注入された胚は、さらなる分析のためembryonicallyまたは出生後に犠牲にすることができます。ウイルスがヒトアルカリホスファターゼ（PLAP）またはGFPなどのレポーター遺伝子を発現する場合、染色は、正のウイルス感染（Figure1C）の領域を明らかにする。

代表的な結果

注入された胚は、成人するまで1〜2日後の注入を完全に犠牲にすることができます。ウイルスがそのようなPLAPやGFPなどのレポーター遺伝子を発現する場合には、レポーターの発現は、これらの細胞のウイルス感染した細胞やクローンを識別するのに役立ちます。例えば、レトロウイルスベクターを発現PLAPとE9.5で子宮内で感染していた生後の脳の組織切片である図1Cに示す。感染細胞は、組織化学的染色後の紫のクラスターとして視覚化されます。ウイルスに感染した細胞を識別することに加え、レポーターの発現は1つが、細胞の形態や位置だけでなく、遺伝子発現の状態を調べることができます。

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図1。E9.5マウス前脳の脳室へのウイルスの注射。 A.麻酔動物は、注入のステージに配置されます。二つの胚（矢印）示されている超音波プローブの下にさらされて位置決めされる。ウイルスで満たされたマイクロインジェクションの針は、胚の近くに位置し、超音波プローブをラインアップしています。 E9.5のマウス胚からのリアルタイム超音波画像のB.のスクリーンキャプチャー。 V、心室、AS、羊膜嚢、UW、子宮壁。 C.胚はE10.5でPLAP発現ウイルスを注入した。 PLAPのための組織化学的染色では、ウイルス感染のイベントの場所を明らかにする。

Discussion

超音波ガイドを使用してウイルスの注射は、羊膜嚢と脳室系の両方がE9.5 - E11.5から注入することができますが唯一の羊膜嚢は、E8.5で注入することができますE8.5 - E11.5、から行うことができる。正しく実行するときに、超音波ガイドを使って脳室系に注入されたウイルス粒子は、従って、前脳（大脳新皮質、大脳基底核、間脳、目、など）、中脳の様々な構造に感染する可能性が、脳室系を覆う細胞へのアクセス権を持っていると、と後脳（Figure1C）。羊膜嚢に注入されたウイルスは、胚​​の外側のセルへのアクセス権を持っています。ウイルスに加えて、超音波ガイダンスはまた、発展途上胚に細胞を注入することができます。したがって、この手法は、実験を設計するときに（発育期間、構造、ウイルス/細胞）から選択する複数のオプションが用意されています。

それは、注入されたウイルスまたは細胞が感染/注入された細胞の容易に識別するためのレポーターを発現することが重要です。歴史的に、ヒト胎盤アルカリホスファターゼ（PLAP）またはGFPが使用されている。経験から、我々は両方PLAP組織化学的および免疫組織化学的染色は、一細胞の形態や位置を分析し、そしてクローン分析ができるようにするために、その染色シャープと明確な単一のセルをもたらすので、PLAPは非常に有用なレポーター遺伝子であることができる発見した。ウイルスのGFPの発現がかすかにすることができるので、GFPレポーターは、組織を染色するための理想的ではないかもしれませんが、いずれかの蛍光活性化細胞選別（FACS）によって、単一のセルを取得したい場合に便利です。

Materials