Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
نحن هنا تقديم مناعي لونين (CHIP) إجراء تحليل لموقع الجينوم واسعة من الأشكال الإسوية البروتين التي تختلف في مجال هيستون ملزم. نحن تطبيقه على رقاقة تسلسل تحليل لتحديد أهداف في demethylase هيستون KDM5A/JARID1A/RBP2.
توظيف عوامل جينية والنسخي إلى أهدافهم هو خطوة رئيسية في تنظيمها. يحتل مكانة بارزة في مجالات التوظيف هي البروتينات التي تربط لتعديلات بسيطة محددة. مجال واحد من هذا القبيل هو homeodomain النبات (الدكتوراه) ، وجدت في بروتينات الكروماتين ملزمة عدة. وRBP2 عامل جينية متعددة المجالات والدكتوراه ، لكن لديهم وظائف مختلفة (الشكل 4). على وجه الخصوص ، C - محطة الدكتوراه المجال ، وجدت في التحام RBP2 أنكجنيك اللوكيميا في الإنسان ، وبربط trimethylated يسين 4 في H3 هيستون (H3K4me3) 1. نص المقابلة للشكل الإسوي RBP2 تحتوي على الدكتوراه محطة C - يتراكم خلال تمايز الخلايا promonocytic U937 ، المستمدة من سرطان الغدد الليمفاوية ، إلى حيدات 2. وأظهر تحليل الجينوم واسعة بما يتفق مع كل من مجموعات من البيانات ، وذلك في الخلايا U937 متباينة ، ويحصل على البروتين RBP2 المترجمة إلى مناطق الجينوم عالي التخصيب لH3K4me3 3. توطين RBP2 إلى أهدافها يرتبط مع انخفاض في H3K4me3 بسبب RBP2 demethylase هيستون النشاط وانخفاض في النشاط الترانسكربتي. في المقابل ، شهادتي دكتوراه أخرى من RBP2 غير قادر على ربط H3K4me3. تجدر الإشارة إلى أن محطة C - المجال الدكتوراه من RBP2 غائبة في شكل الإسوي أصغر RBP2 4. ومن المتصور أن شكل الإسوي صغيرة من RBP2 ، التي تفتقر إلى التفاعل مع H3K4me3 ، يختلف عن شكل الإسوي أكبر في الموقع الجيني. فإن الاختلاف الجيني في الموقع من الأشكال الإسوية RBP2 حساب التنوع الملحوظ في RBP2 الدالة. على وجه التحديد ، RBP2 لاعب حاسم في تمايز الخلايا بوساطة البروتين الشبكية (PRB). حددت والمتسقة مع هذه البيانات ، وتحليل الجينوم السابقة واسعة ، دون تمييز بين الأشكال الإسوية ، مجموعتين متميزتين من الجينات المستهدفة RBP2 : 1) الجينات ملزمة RBP2 بطريقة مستقلة عن التمايز ؛ 2) جينات ملزمة RBP2 في التمايز ، تعتمد الطريقة.
لتحديد الاختلافات في الترجمة بين الأشكال الإسوية أجرينا تحليل الجينوم على نطاق الموقع بواسطة تسلسل رقاقة. باستخدام الأجسام المضادة التي تكشف عن كل من الأشكال الإسوية RBP2 دينا تقع جميع الأهداف RBP2. بالإضافة إلى ذلك لدينا فقط الأجسام المضادة التي تربط الكبيرة ، والصغيرة لا RBP2 شكل الإسوي (الشكل 4). بعد تحديد الأهداف شكل الإسوي كبيرة ، يمكن للمرء ثم طرح عليهم من كل الأهداف RBP2 لكشف أهداف شكل الإسوي الصغيرة. هذه البيانات تظهر مساهمة الكروماتين التفاعل المجال في التوظيف البروتين لمواقعها ملزمة في الجينوم.
وقد تم تكييف أصلا من بروتوكول رن B. ، 2001. فهو يمثل تعديل طفيف على البروتوكول أودوم وآخرون (5) التي يمكن العثور عليها في http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi؟s=22&f=appendices_downloads
1. (ينبغي أن يكون أداؤها في الليلة التي سبقت الخطوة التالية) قبل كتلة من الأجسام المضادة وملزمة لحبات المغناطيسي
2. الخلية عبر ربط
3. خلية صوتنة
4. مناعي لونين
5. التضخيم من الحمض النووي الجينومي
6. هلام تنقية المنتجات تضخيم
7. ممثل النتائج
الشكل 1. والهدف العام لهذه التجربة التالية هي تحديد الأهداف الجينومية من KDM5A/JARID1A/RBP2 demethylase هيستون.
(P1) ويتحقق ذلك عن طريق إعداد عبر ربط لونين التي sonicated لإنتاج شظايا من الحمض النووي من الحجم المناسب. (P2) وكخطوة ثانية ، وimmunoprecipitated RBP2 شظايا من الحمض النووي ملزمة RBP2 مع الأجسام المضادة. (P3) المقبل ، ويتم إصلاح الحمض النووي شظايا استردادها في نهايات وو تربط محولات على نهايات الحمض النووي الجيني لإعداد مكتبات الحمض النووي الجيني للتحليل على خلايا تدفق في محطة الكتلة البورشيد. وتتضخم هذه المكتبات عن طريق الحمض النووي PCR باستخدام عدد قليل من الدورات. (P4) وأخيرا ، البورشيد قصيرة متسلسلة يتم محاذاة يقرأ على نحو فريد لالجينوم البشري ، ويتم تحديد قمم هامة ومشروحة لأقرب الجينات من أجل تحديد المناطق RBP2 المخصب. (P5) ويتم الحصول على النتائج التي تظهر وظائف الجينات الجزيئية المرتبطة RBP2 الهدف على أساس الجينوم على نطاق تحديد المناطق RBP2 المخصب.
الشكل 2. تم التحقق من النتائج التي صوتنة لونين للتحقق من أحجام شظايا من الحمض النووي التي تنتجها صوتنة الداخلي ، وتحميلها 5 ميكروغرام (1 / 10) من العينة على تنقية مدخلات 1.8 ٪ agarose هلام. كما هو متوقع ، أنتجت إجراءاتنا صوتنة شظايا في حدود 150-350 الغليان. ومع ذلك ، إذا شظايا لا تقع في هذا النطاق ، ينبغي تعديل الإجراء صوتنة تبعا لذلك ، من خلال تغيير عدد من رشقات نارية والسعة و.
الشكل 3. هلام تنقية المنتجات تضخيمها. تدار المنتجات PCR على جل لإزالة محولات وحدد حجم المدى نماذج لكتلة منصة جيل. هذا يدل على أن جل أنتجت شظايا في نطاق بين 150 و 350 أزواج قاعدة. وهي تمثل شظايا الحمض النووي الجيني بين أزواج 50 و 250 قاعدة في طول ومحول ملف. نحن استئصال المنطقة المحددة من هلام مع مشرط. وينبغي الحرص على تجنب الفرقة محول محول ، الذي يقام في حوالي 120 قاعدة أزواج.
الشكل 4. شكل الإسوي محددة الضد يسمح بالتمييز بين الأشكال الإسوية كبيرة وصغيرة من RBP2. RBP2 يرد هيكل البروتين في عرض المجال. RBP2 يحتوي على عدة مجالات : الحفاز هيستون نزع الميثيل JmjC المجال وما يرتبط بها من JmjN المجال ، مجال القاحلة قادرة على تسلسل الحمض النووي محددة وملزمة ، والاصبع الزنك C5HC2 التي قد تتفاعل مع الحمض النووي المحتمل أو غيرها من البروتينات ، ومتعددة المجالات الدكتوراه. وقد استمدت اثنين مكافحة RBP2 الأجسام المضادة التي تسمح بالتمييز بين الأشكال الإسوية RBP2 ضد شظايا RBP2 أشارت بخطوط سميكة.
الشكل 5A. نظرة عامة على المناطق RBP2 ملزم مع كروموسوم والجينات Ensembl. ترد إحداثيات الجينوم من RBP2 المخصب المحددة (وجميع الأشكال الإسوية شكل الإسوي كبير) المناطق ملزمة كروموسوم الحكيمة. Occupances الجينات Ensembl (الإصدار 54 ؛ hg18) في الصبغيات (الكروموسومات 10 في هذه الصورة) هي كما عرضت أشرطة سوداء (لوحة العلوي). ويمثل كل منطقة RBP2 ملزمة حسب خط عمودي ، حيث يظهر كل لوحة المتوسطة الأشكال الإسوية RBP2 المناطق ملزمة على الصبغي 10 ، وأسفل اللوحة يوضح شكل الإسوي RBP2 مناطق كبيرة ملزمة. ووسط لوحات تعطي نظرة عامة على الجزء السفلي من التداخل وإشغال محددة من الأشكال الإسوية RBP2 على الصبغي 10.
الرقم 5B. تصحيح وظيفي تحليل الجينات المستهدفة تخصيب RBP2. Heatmap تظهر بشكل ملحوظ روزفلت (ف قيمة ≤ 0.05) GO المخصب فئات الفعل بين الجينات الجزيئية منضم (الجينات الأقرب إلى منطقة ملزمة RBP2) بواسطة RBP2 (جميع الأشكال الإسوية والكبيرة). الألوان الحمراء تشير إلى ارتفاع نحو دلالة إحصائية ، الأصفر يدل دلالة إحصائية منخفضة ، ويشير اللون الرمادي أي دلالة إحصائية. ويبين تحليل تخصيب التداخل وشكل الإسوي ظائف محددة من الجينات الجزيئية RBP2 الهدف.
لم تكن الفروق الوظيفية بين الأشكال الإسوية RBP2 تحديدها. وقد استخدمنا منهج شامل لتحديد المناطق الجينومية ملزمة RBP2 الأشكال الإسوية وتحديد الفئات الوظيفية التي تمثل هذه المناطق. وقد تحقق ذلك من خلال تحليل تسلسل الرقائق تليها تحليل المعلومات البيولوجية التي تم الحصول عليها من تسلسل القراءات.
RBP2 تعديل بقايا يسين ميثليته على الذيول هيستون. وجدنا أن RBP2 شكل الإسوي كبيرة تحتوي على وحدة تقديرا لميثليته شكل الإسوي هيستون يسين صغيرة وتفتقر هذه RBP2 ربط وحدة لمختلف المناطق في الجينوم البشري (الشكل 5A). الأهم من ذلك ، شكل الإسوي مناطق محددة ومناطق التداخل تنتمي إلى الجينات الجزيئية ذات وظائف مختلفة (الشكل 5B). على سبيل المثال ، يمكن أن يعزى "لونين ملزمة" و "النسخ عامل ملزم" وظائف الجينات إلى أهداف من RBP2 شكل الإسوي صغيرة ولكنها ليست من RBP2 شكل الإسوي كبيرة (الشكل 5B). بمقارنة الجينات الفعلية لجميع مجموعات توليد الأشكال الإسوية وRBP2 شكل الإسوي كبيرة (لا تظهر البيانات) ، فإننا يمكن أن تحدد أيضا إذا تم تعيينهم على وجه التحديد شكل الإسوي كبيرة لجينات معينة.
وأيد هذا العمل من قبل 115347 - RSG - 08 271-01 - GMC - منحة من الرابطة ، وCA138631 من المعاهد الوطنية للصحة.
متواليات قليل النوكليوتيد 2006 البورشيد ، وشركة جميع الحقوق محفوظة.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved