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Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
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Biology
在这里,我们提出的全基因组的不同在一个组蛋白结合结构域的蛋白异构体的位置分析染色质免疫沉淀(ChIP)的过程。我们把它应用到芯片的SEQ分析,以确定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶的目标。
招聘转录和表观遗传因素对他们的目标是在调控的关键一步。突出在招聘绑定到特定的组蛋白修饰的蛋白结构域。这样一个领域是植物同源结构域(PHD),发现在几个染色质结合蛋白。后生因素RBP2多PHD域,然而,他们具有不同的功能(图4)。特别是,C -末端PHD域,发现在RBP2在人类白血病的致癌融合,结合,以三甲基赖氨酸4组蛋白H3(H3K4me3)1 。相应的谈话内容RBP2亚型,含有C -末端PHD promonocytic,淋巴瘤衍生成单核细胞 2,U937细胞分化过程中积累。这两组数据相一致,全基因组分析显示,在已分化的U937细胞,RBP2蛋白质获取本地化H3K4me3 3高度浓缩的基因组区域。 RBP2组蛋白去甲基化酶活性和转录活性的下降,由于减少在H3K4me3相关的RBP2其目标定位。相比之下,两个其他博士RBP2无法绑定H3K4me3。值得注意的是,RBP2的C端结构域博士是在较小的RBP2亚型4缺席。可以想象的是,RBP2小异构体,缺乏互动,与H3K4me3较大的异构体在基因组的位置不同。 RBP2亚型基因组的位置差异或许可以解释观察到的多样性RBP2功能。具体来说,RBP2是在视网膜母细胞瘤蛋白(PRB)介导的细胞分化的关键球员。与这些数据亚型之间没有区别,以前的全基因组分析,相一致,确定RBP2靶基因的两个不同的群体:1)由RBP2约束的方式,是独立的分化的基因; 2)绑定到RBP2基因分化依赖性。
为了确定本地化的异构体之间的差异,我们进行了全基因组的位置分析芯片序号。利用抗体检测RBP2我们已经找到所有RBP2目标亚型。此外,我们还只有绑定大,不小的RBP2异构体(图4)的抗体。大型异构体的目标确定后,再减去从所有RBP2目标揭示小异构体的目标。这些数据显示,其结合位点的基因组中的染色质相互作用的蛋白质招聘域的贡献。
从B,2001年任该协议最初是适应。它代表了奥多姆等协议的轻微修改。5,可在发现 http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1。前块和结合抗体的磁珠(应执行下一步前的晚上)
2。细胞的交联
3。细胞超声
4。染色质免疫沉淀
5。基因组DNA的扩增
6。扩增产物的凝胶净化
7。代表性的成果
图1。以下实验的总体目标是,确定KDM5A/JARID1A/RBP2组蛋白去甲基化酶基因目标。
(P1)这是通过交联的染色质,是超声产生适当大小的DNA片段的准备。 (P2),作为第二步,RBP2结合的DNA片段与RBP2抗体免疫沉淀。 (P3),接下来,回收DNA片段在两端修复和适配器上的基因组DNA的两端结扎Illumina的群集站流量细胞基因组DNA库,以备分析。使用周期低PCR扩增的DNA库。 (P4),最后,Illumina的测序短读取唯一的人类基因组对齐,重要的山峰是识别和注释到最接近的基因,以确定RBP2丰富的地区。 (P5)的结果,得到显示基于RBP2丰富地区的全基因组识别与RBP2目标基因相关的分子功能。
图2。染色超声检查的结果,检查由超声过程中产生的DNA片段的大小,纯化输入样本的5微克(1 / 10)装上1.8%的琼脂糖凝胶。正如预期的那样,我们的超声过程范围在150-350 bp的片段。然而,如果碎片不属于这个范围,超声程序应作相应调整,由不同的阵阵数量和幅度。
图3。凝胶纯化扩增产物。PCR产物凝胶上运行,删除的适配器,并选择一个集群代平台的模板的大小范围。这种凝胶显示范围在150至350个碱基对的片段进行生产。他们代表之间的50和250个碱基对的长度和一个适配器,基因组DNA片段。我们消费的凝胶用手术刀选定的区域。应注意避免适配器,适配器带,运行约120个碱基对。
图4。亚型特异性抗体允许RBP2大型和小型亚型之间的区别 。RBP2蛋白质结构域视图。 RBP2包含多个域:催化的组蛋白去甲基化JmjC域和相关JmjN域,干旱域序列特异的DNA结合,C5HC2锌指潜在可能与DNA或其他蛋白质,多PHD域交互。两个反RBP2的抗体,使RBP2异构体之间的区分,是根据对粗线表示的RBP2片段。
图5a。概述RBP2与染色体和Ensembl基因的结合区域,确定丰富RBP2基因组坐标(所有异构体和大型异构体)结合区域是染色体明智。 Occupances Ensembl基因在染色体(54版; hg18)(图片10号染色体)黑网吧(顶部面板)。每RBP2结合区域表示为一条垂直线,中间的面板显示所有RBP2亚型10号染色体上的结合区域,底部面板显示RBP2大型异构体结合区域。中部和底部面板让重叠的概述和10号染色体上的RBP2亚型的特定入住。
图5b。 RBP2靶基因功能富集分析,热图显示罗斯福纠正显着(P值≤0.05)丰富当中去约束RBP2(所有大型异构体)(最接近的基因RBP2结合区域)的基因的分子功能分类。偏红的颜色表示高统计学意义,黄色表示低统计学意义,灰色表示无统计学意义。富集分析显示重叠和异构体的具体RBP2靶基因的分子功能。
RBP2异构体之间功能上的差异尚未确定。我们已经使用了一个全面的方式来确定约束RBP2亚型的基因组区域和定义,这些地区所代表的功能类别。这是通过获得序列的生物信息学分析读取芯片SEQ分析。
RBP2修改的组蛋白尾巴的甲基化赖氨酸残基。我们发现,RBP2大型异构体中含有甲基化的组蛋白赖氨酸和RBP2小,缺乏这种模块绑定到不同地区的人类基因组中(图5A)的亚型识别模块。更重要的是,异构体的特定区域和重叠的区域,属于基因具有不同的分子功能(图5B)。例如,“染色约束力”和“转录因子结合”功能,可以归因于RBP2小亚型的基因目标,但不是RBP2大型异构体(图5B)。通过比较实际的基因组产生的所有异构体和RBP2大型异构体(数据未显示),我们也可以定义,如果大量的异构体是专门招募某些基因。
这项工作是支持115347 - RSG - 08 - 271 - 01 - GMC从ACS,并通过CA138631授予由美国国立卫生研究院。
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