Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Hier presenteren we een chromatine immunoprecipitatie (ChIP) procedure voor genoom-brede locatie analyse van eiwit-isovormen die verschillen in een histon-bindend domein. We zijn toe te passen op ChIP-Seq analyse om de doelstellingen van het KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase te identificeren.
Werving van transcriptionele en epigenetische factoren om hun doelstellingen is een belangrijke stap in hun regelgeving. Prominent in werving zijn het eiwit domeinen die binden aan specifieke histon modificaties. Een voorbeeld van zo'n domein is de plant homeodomein (PHD), gevonden in verschillende chromatine-eiwitten. De epigenetische factor RBP2 heeft meerdere PHD domeinen, maar ze hebben verschillende functies (figuur 4). Met name de C-terminale PHD domein, gevonden in een RBP2 oncogeen fusie in de menselijke leukemie, bindt aan trimethylated lysine 4 in histon H3 (H3K4me3) 1. Het transcript die overeenkomt met de RBP2 isovorm met de C-terminale PHD accumuleert tijdens de differentiatie van promonocytic, lymfoom-afgeleide, U937 cellen in monocyten 2. In overeenstemming met beide sets van gegevens, genoom-brede analyse toonde aan dat in gedifferentieerde U937-cellen, de RBP2 eiwit wordt gelokaliseerd genomische regio's hoogverrijkt voor H3K4me3 3. Lokalisatie van RBP2 om haar doelstellingen correleert met een afname van de H3K4me3 te wijten aan RBP2 histon demethylase activiteit en een afname van de transcriptionele activiteit. In tegenstelling tot twee andere PHDs van RBP2 zijn niet in staat om H3K4me3 te binden. Met name de C-terminale domein van PHD RBP2 afwezig is in de kleinere RBP2 isovorm 4. Het is denkbaar dat de kleine isovorm van RBP2, die de interactie ontbreekt met H3K4me3, verschilt van de grotere isovorm in genomische locatie. Het verschil in genomische locatie van RBP2 isovormen rekening kan worden gehouden voor de waargenomen diversiteit in RBP2 functie. In het bijzonder, RBP2 is een cruciale speler in cellulaire differentiatie gemedieerd door de retinoblastoma eiwit (PRB). In overeenstemming met deze gegevens, vorige genome-wide analyse, zonder onderscheid te maken tussen isovormen, geïdentificeerd twee verschillende groepen van RBP2 doelwitgenen: 1) genen die gebonden zijn door RBP2 op een manier die onafhankelijk is van differentiatie, 2) genen die gebonden zijn door RBP2 in een differentiatie- afhankelijke manier.
Het identificeren van de verschillen in lokalisatie tussen de isovormen voerden wij genoom-brede locatie analyse door ChIP-Seq. Met behulp van antilichamen die zowel RBP2 isovormen hebben we verspreid RBP2 doelen op te sporen. Daarnaast hebben we antistoffen die alleen binden groot, en geen kleine RBP2 isoform (figuur 4). Na het identificeren van de grote isovorm doelstellingen, kan men dan aftrekken hen van alle RBP2 doelstellingen om de doelstellingen van de kleine isovorm onthullen. Deze gegevens geven de bijdrage van chromatine-interagerende domein in eiwit rekrutering van de bindingsplaatsen in het genoom.
Het protocol werd oorspronkelijk aangepast van B. Ren, 2001. Het is een lichte wijziging van het protocol door Odom et al.. 5 die gevonden kunnen worden op http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Pre-blok en binding van antilichaam aan magnetische beads (dient te worden uitgevoerd in de nacht voor de volgende stap)
2. Cel cross-linking
3. Cel Ultrasoonbehandeling
4. Chromatine Immunoprecipitatie
5. Amplificatie van genomisch DNA
6. Gel zuivering van geamplificeerde producten
7. Representatieve resultaten
Figuur 1. Het algemene doel van het volgende experiment is het identificeren van genomische doelen van KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase.
(P1) Dit wordt bereikt door de voorbereiding van de cross-linked chromatine, dat is gesoniceerd om DNA-fragmenten van de juiste maat te produceren. (P2) Als tweede stap worden RBP2 gebonden DNA-fragmenten immunogeprecipiteerd met RBP2 antilichamen. (P3) Vervolgens worden de herstelde DNA-fragmenten gerepareerd aan de uiteinden en adapters worden geligeerd op de uiteinden van genomische DNA om bibliotheken van genomisch DNA voor te bereiden op analyse van de stroming cellen in de Illumina Cluster Station. De DNA-bibliotheken worden geamplificeerd door PCR met behulp van lage aantal cycli. (P4) Ten slotte, Illumina volgorde kort leest zijn uniek afgestemd op het menselijk genoom, zijn significante pieken geïdentificeerd en geannoteerde naar de dichtstbijzijnde genen om RBP2 verrijkt regio's te identificeren. (P5) de resultaten zijn verkregen die aantonen dat moleculaire functies geassocieerd met RBP2 doelwitgenen op basis van genoom-brede identificatie van RBP2 verrijkt regio's.
Figuur 2. Het controleren van de resultaten van het chromatine ultrasoonapparaat Om de grootte van de DNA-fragmenten die door de sonicatie procedure te verifiëren, werd 5 pg (1 / 10) van het gezuiverde ingang sample geladen op 1,8% agarose gel. Zoals verwacht, onze sonicatie procedure geproduceerd fragmenten in het bereik van 150-350 bp. Echter, als de fragmenten vallen niet in dit bereik, moet de sonicatie procedure worden aangepast, door het variëren van het aantal barst en de amplitude.
Figuur 3. Gel zuivering van geamplificeerde producten. De PCR-producten worden uitgevoerd op een gel om de adapters te verwijderen en een grootte-range van sjablonen voor de cluster generatie platform te selecteren. Deze gel laat zien dat fragmenten in het bereik tussen 150 en 350 basenparen werden geproduceerd. Zij vertegenwoordigen genomische DNA-fragmenten tussen de 50 en 250 basenparen in lengte en een adapter. We accijnzen het geselecteerde gebied van de gel met een scalpel. Zorg moet worden genomen om de adapter-adapter band, die loopt van ongeveer 120 baseparen te voorkomen.
Figuur 4. Isovorm-specifieke antilichaam maakt onderscheid tussen grote en kleine isovormen van RBP2. RBP2 eiwitstructuur wordt gepresenteerd in het domein te bekijken. RBP2 bevat een aantal domeinen: de katalytische histon demethylering JmjC domein en bijbehorende JmjN domein, een ARID domeinnaam in staat is van sequentie-specifieke DNA-binding, een C5HC2 zinkvinger die mogelijk kunnen interageren met DNA of andere eiwitten, en meerdere PHD domeinen. De twee anti-RBP2 antilichamen die het mogelijk maken onderscheid te maken tussen RBP2 isovormen zijn afgeleid ten opzichte van de RBP2 fragmenten aangegeven met dikke lijnen.
Figuur 5a. Overzicht van de RBP2 binding regio's, samen met chromosoom en Ensembl genen. Genomische coördinaten van de geïdentificeerde verrijkt RBP2 (alle isovormen en grote isovorm) binding regio's worden gepresenteerd chromosoom wijs. Occupances van Ensembl genen (versie 54, hg18) in de chromosomen (chromosoom 10 op deze foto) worden gepresenteerd als zwarte balken (bovenste paneel). Elke RBP2 binding regio wordt voorgesteld als een verticale lijn, waar de middelste paneel toont alle RBP2 isovormen bindend regio's op chromosoom 10, en het onderste paneel toont RBP2 grote isovorm binding regio's. De middelste en onderste panelen geven overzicht van overlappende en specifieke bezetting van RBP2 isovormen op chromosoom 10.
Figuur 5b. Functionele analyse van de verrijking RBP2 doelwitgenen. Temperatuurkaart toont FDR gecorrigeerd significant (p-waarde ≤ 0,05) verrijkt Moleculaire Functie categorieën GO onder de genen gebonden (het dichtst genen om de RBP2 binding regio) door RBP2 (alle grote en isovormen). Kleuren in de richting van rood geven een hoge statistische significantie, geel betekent een lage statistische significantie, en grijs geeft geen statistische significantie. Verrijking analyse toont de overlappende en isovorm specifieke moleculaire functies van RBP2 doelwitgenen.
Functionele verschillen tussen RBP2 isovormen zijn niet vastgesteld. We hebben gebruik gemaakt van een alomvattende aanpak van genomische regio's gebonden RBP2 isovormen te identificeren en de functionele categorieën die deze regio's vertegenwoordigen definiëren. Dit werd bereikt door ChIP-Seq analyse gevolgd door bio-informatica analyse van de verkregen volgorde leest.
RBP2 wijzigt gemethyleerde lysine residuen op histon staarten. Wij vonden dat RBP2 grote isovorm de erkenning module bevat voor gemethyleerd histon-lysine en RBP2 kleine isovorm zonder deze module binden aan verschillende regio's in het menselijke genoom (figuur 5A). Belangrijk is dat isovorm-specifieke regio's en overlappende regio's behoren tot genen met verschillende moleculaire functies (figuur 5B). Bijvoorbeeld, "chromatine binding" en "transcriptiefactor binding" functies kunnen worden toegeschreven aan gen-targets van RBP2 kleine isovorm, maar niet van RBP2 grote isovorm (Figuur 5B). Door het vergelijken van de werkelijke gen sets gegenereerd voor alle isovormen en RBP2 grote isovorm (gegevens niet getoond), hebben we ook kunnen definiëren als de grote isovorm is speciaal aangetrokken om bepaalde genen.
Dit werk werd ondersteund door 115.347-RSG-08-271-01-GMC van ACS, en door CA138631 subsidie van NIH.
Oligonucleotidesequenties 2006 Illumina, Inc All rights reserved.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved