Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Ici, nous présentons une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) procédure pour analyse de la localisation du génome entier d'isoformes de protéines qui diffèrent dans un domaine histone-contraignant. Nous sommes en l'appliquant à ChIP-Seq analyse pour identifier les cibles de la déméthylase KDM5A/JARID1A/RBP2 histones.
Le recrutement de facteurs transcriptionnels et épigénétiques de leurs objectifs est une étape clé dans leur régulation. Place de choix dans le recrutement sont les domaines de protéines qui se lient aux modifications des histones spécifiques. Un domaine est l'homéodomaine plante (PHD), trouvés dans plusieurs chromatine des protéines de liaison. Le facteur de RBP2 épigénétique a de multiples domaines PHD, cependant, ils ont des fonctions différentes (figure 4). En particulier, le C-terminale du domaine PHD, a trouvé dans une fusion RBP2 oncogènes dans la leucémie humaine, se lie à triméthylée lysine 4 de l'histone H3 (H3K4me3) 1. La transcription correspondant à l'isoforme RBP2 contenant le PHD C-terminale s'accumule pendant la différenciation des promonocytaire, lymphomes dérivés, les cellules U937 en monocytes 2. Conformément aux deux ensembles de données, l'analyse du génome entier ont montré que dans les cellules U937 différenciées, la protéine localisée à RBP2 obtient régions génomiques hautement enrichi pour H3K4me3 3. Localisation des RBP2 à ses objectifs en corrélation avec une diminution due à H3K4me3 RBP2 activité déméthylase histone et une diminution de l'activité transcriptionnelle. En revanche, deux doctorats autres RBP2 sont incapables de se lier H3K4me3. Notamment, le domaine C-terminal de doctorat de RBP2 est absent dans la petite RBP2 isoforme 4. Il est concevable que l'isoforme de la petite RBP2, qui manque d'interaction avec les H3K4me3, diffère de la grande isoforme de localisation génomique. La différence de localisation génomique des RBP2 isoformes peuvent rendre compte de la diversité observée dans RBP2 fonction. Plus précisément, RBP2 est un acteur essentiel dans la différenciation cellulaire médiée par la protéine du rétinoblastome (pRB). Conformément à ces données, l'échelle du génome précédente analyse, sans distinction entre les isoformes, a identifié deux groupes distincts de gènes cibles RBP2: 1) les gènes liés par RBP2 d'une manière qui est indépendante de la différenciation, 2) les gènes liés par RBP2 dans une différenciation manière dépendante.
Pour identifier les différences de localisation entre les isoformes nous avons effectué une analyse du génome entier emplacement par ChIP-Seq. En utilisant des anticorps qui permettent de détecter à la fois RBP2 isoformes nous avons localisé l'ensemble RBP2 cibles. En outre, nous avons des anticorps qui se lient seulement grand, et pas de petits RBP2 isoforme (Figure 4). Après l'identification des cibles isoforme grande, on peut alors les soustraire de toutes les cibles RBP2 pour révéler les cibles de l'isoforme de petite taille. Ces données montrent la contribution de la chromatine en interaction de domaine dans le recrutement de protéines pour ses sites de liaison dans le génome.
Le protocole a été adapté de B. Ren, 2001. Il représente une légère modification du protocole par Odom et al. 5, qui se trouve à l' http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Pré-bloc et fixation de l'anticorps à des billes magnétiques (doit être effectué la nuit avant l'étape suivante)
2. Cellule de réticulation
3. Sonication cellulaire
4. Immunoprécipitation de la chromatine
5. Amplification de l'ADN génomique
6. Purification sur gel des produits amplifiés
7. Les résultats représentatifs
Figure 1. L'objectif global de l'expérience suivante est d'identifier les cibles génomiques de KDM5A/JARID1A/RBP2 déméthylase histones.
(P1) Ce résultat est obtenu par la préparation de la chromatine réticulée qui est soniqué pour produire des fragments d'ADN de taille appropriée. (P2) Dans une deuxième étape, les fragments d'ADN liés RBP2 sont immunoprécipités avec RBP2 anticorps. (P3) Ensuite, les fragments d'ADN récupérés sont réparés aux extrémités et les adaptateurs sont ligaturés sur les extrémités de l'ADN génomique pour préparer des bibliothèques d'ADN génomique pour l'analyse sur les cellules d'écoulement dans la station Pôle Illumina. Les banques d'ADN sont amplifiés par PCR en utilisant le faible nombre de cycles. (P4) Enfin, Illumina séquencé courtes lectures sont alignés de façon unique au génome humain, des pics significatifs sont identifiés et annotés à la plus proche des gènes afin d'identifier les régions RBP2 enrichi. (P5) Les résultats sont obtenus montrent que les fonctions moléculaires associés à RBP2 gènes cibles basées sur l'échelle du génome l'identification des régions enrichi RBP2.
Figure 2. Vérification des résultats de sonication chromatine Pour vérifier la taille des fragments d'ADN produites par la procédure sonication, 5 ug (1 / 10) de l'échantillon d'entrée purifiée a été chargé sur 1,8% gel d'agarose. Comme prévu, notre procédure sonication produit des fragments de l'ordre de 150 à 350 pb. Cependant, si les fragments ne tombent pas dans cette gamme, la procédure sonication doit être ajustée en conséquence, en faisant varier le nombre de salves et de l'amplitude.
Figure 3. Purification sur gel des produits amplifiés. Les produits de PCR sont exécutées sur un gel pour éliminer les adaptateurs et sélectionnez un format de gamme de modèles pour la génération de plateforme cluster. Ce gel montre que des fragments dans la gamme entre 150 et 350 paires de bases ont été produites. Ils représentent des fragments d'ADN génomique entre 50 et 250 paires de base de longueur et d'un adaptateur. Nous accise de la région sélectionnée de gel avec un scalpel. Des précautions doivent être prises pour éviter la bande adaptateur adaptateur, qui fonctionne à environ 120 paires de bases.
Figure 4. Isoform anticorps spécifiques permet de distinguer entre les grandes et petites isoformes du RBP2. RBP2 la structure des protéines est présenté en vue de domaine. RBP2 contient plusieurs domaines: le catalyseur d'histone déméthylation JmjC domaine et associés JmjN domaine, un domaine ARIDES capable de séquences de liaison spécifique de l'ADN, un doigt de zinc C5HC2 qui peuvent potentiellement interagir avec l'ADN ou d'autres protéines, et de multiples domaines PHD. Les deux anticorps anti-RBP2 qui permettent la distinction entre RBP2 isoformes ont été tirées contre le RBP2 fragments indiqués par des lignes épaisses.
La figure 5a. Vue d'ensemble des régions RBP2 de liaison ainsi que des chromosomes et les gènes Ensembl. Coordonnées génomiques de RBP2 identifié enrichi (toutes les isoformes et de l'isoforme de grande taille) des régions de liaison sont présentés chromosomes sage. Occupances de gènes Ensembl (version 54; hg18) dans les chromosomes (le chromosome 10 dans cette image) sont présentés comme des barres noires (panneau supérieur). Chaque région RBP2 liaison est représentée par une ligne verticale, où le panneau du milieu montre toutes les isoformes RBP2 régions de liaison sur le chromosome 10, et le panneau du bas montre RBP2 régions isoforme grande contraignant. Le milieu et en bas des panneaux donnent aperçu de chevauchement et de l'occupation spécifique de RBP2 isoformes sur le chromosome 10.
La figure 5b. L'analyse d'enrichissement fonctionnel de RBP2 gènes cibles. Heatmap montrant FDR corrigée de façon significative (valeur p ≤ 0,05) enrichi GO catégories Fonction moléculaire entre les gènes liés (le plus proche des gènes de la région RBP2 contraignante) par RBP2 (isoformes tous et de grande taille). Couleurs vers le rouge indiquent la significativité statistique élevé, jaune indique une signification statistique faible, et le gris indique l'absence de signification statistique. L'analyse d'enrichissement montre les chevauchements et isoforme spécifique des fonctions moléculaires de RBP2 gènes cibles.
Les différences fonctionnelles entre RBP2 isoformes n'ont pas été déterminées. Nous avons utilisé une approche globale pour identifier les régions génomiques liés par RBP2 isoformes et de définir les catégories fonctionnelles que ces régions représentent. Cela a été accompli par ChIP-Seq analyse suivie par l'analyse bioinformatique des séquences obtenues lit.
RBP2 modifie méthylé résidus lysine sur la queue des histones. Nous avons constaté que RBP2 isoforme de grande taille contenant le module de reconnaissance pour méthylé isoforme histone petite lysine et RBP2 dépourvues de ce module pour lier les différentes régions dans le génome humain (figure 5A). Surtout, l'isoforme spécifique des régions et des régions qui se chevauchent appartiennent à des gènes de différentes fonctions moléculaires (figure 5B). Par exemple, «chromatine contraignante" et "facteur de transcription liant« les fonctions peuvent être attribuées à des gènes cibles RBP2 isoforme petit mais pas des RBP2 isoforme de grande taille (figure 5B). En comparant les gènes réels générés pour tous les ensembles et les isoformes RBP2 isoforme de grande taille (données non présentées), on peut aussi définir si l'isoforme grande est spécialement recruté pour certains gènes.
Ce travail a été soutenu par 115 347-RSG-08-271-01-GMC d'ACS, et par CA138631 subventions du NIH.
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