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Biology
Hier präsentieren wir eine Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP) Verfahren zur genomweiten Ort Analyse von Protein-Isoformen, die in einer Histon-bindende Domäne unterscheiden. Wir wenden es ChIP-Seq-Analyse, um die Ziele des KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.
Rekrutierung von Transkriptions-und epigenetische Faktoren, um ihre Ziele ist ein wichtiger Schritt in ihrer Regulierung. Prominent in Rekrutierung featured sind die Protein-Domänen, die auf bestimmte Histon-Modifikationen zu binden. Ein solcher Bereich ist die Anlage homeodomain (PHD), in mehreren Chromatin-bindenden Proteinen gefunden. Die epigenetische Faktor RBP2 mehrere PHD-Domänen, jedoch haben sie unterschiedliche Funktionen (Abbildung 4). Insbesondere bindet die C-terminale Domäne PHD, in einem RBP2 onkogenen Fusion in menschlichen Leukämien gefunden, um trimethyliertes Lysin 4 in Histon H3 (H3K4me3) 1. Das Transkript entsprechend der RBP2 Isoform mit dem C-terminalen PHD sammelt während der Differenzierung von promonocytic, Lymphom-derived, U937-Zellen in Monozyten 2. In Übereinstimmung mit beiden Datensätzen zeigte genomweite Analyse, dass in differenzierten U937-Zellen, die RBP2 Protein genomischen Regionen in hohem Grade für H3K4me3 3 angereichert wird lokalisiert. Lokalisierung von RBP2 seine Ziele korreliert mit einer Abnahme der H3K4me3 aufgrund RBP2 Histon-Demethylase-Aktivität und eine Abnahme der transkriptionellen Aktivität. Im Gegensatz dazu sind zwei weitere PHDs von RBP2 nicht H3K4me3 binden. Bemerkenswert ist, dass die C-terminale Domäne von PHD RBP2 in den kleineren RBP2 Isoform 4 fehlen. Es ist denkbar, dass die kleinen Isoform RBP2, die Interaktion fehlt mit H3K4me3, von der größeren Isoform in der genomischen Lage unterscheidet. Der Unterschied in der genomischen Lage des RBP2 Isoformen für die beobachtete Vielfalt in RBP2 Funktion Konto. Insbesondere ist RBP2 eine kritische Spieler in der zellulären Differenzierung durch die Retinoblastomprotein (pRB) vermittelt. In Übereinstimmung mit diesen Daten, frühere genomweite Analyse, ohne Unterscheidung zwischen Isoformen, wurden zwei unterschiedliche Gruppen von RBP2 Zielgene: 1) Gene durch RBP2 in einer Weise, die unabhängig von Differenzierung gebunden ist; 2) Gene durch RBP2 in einer gebundenen Differenzierung- abhängigen Weise.
Zur Identifizierung Unterschiede in der Lokalisation zwischen den Isoformen führten wir genomweite Standortanalyse durch ChIP-Seq. Mit Antikörpern, die sowohl RBP2 Isoformen wir alle RBP2 Ziele gefunden haben zu erkennen. Zusätzlich haben wir Antikörper, binden nur groß und nicht klein RBP2 Isoform (Abbildung 4). Nach der Identifizierung der große Isoform Ziele kann man dann davon subtrahieren alle RBP2 Ziele, um die Ziele von kleinen Isoform offenbaren. Diese Daten zeigen, den Beitrag der Chromatin-Interaktion Domain in Protein Einstellung in ihren Bindungsstellen im Genom.
Das Protokoll wurde ursprünglich von B. Ren, 2001 angepasst. Es stellt eine leichte Modifikation des Protokolls durch Odom et al. 5, die Sie hier finden http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Pre-Block und Bindung des Antikörpers an magnetische Kügelchen (Sollte der Nacht vor dem nächsten Schritt ausgeführt werden)
2. Zell-Vernetzung
3. Zell-Beschallung
4. Chromatin Immunopräzipitation
5. Amplifikation von genomischer DNA
6. Gel Reinigung der amplifizierten Produkte
7. Repräsentative Ergebnisse
Abbildung 1. Das übergeordnete Ziel der folgenden Experiments ist es, genomische Ziele KDM5A/JARID1A/RBP2 Histon-Demethylase zu identifizieren.
(P1) Dies ist bei der Vorbereitung der vernetzten Chromatin, beschallt, um DNA-Fragmente geeigneter Größe zu produzieren erreicht ist. (P2) In einem zweiten Schritt werden RBP2 gebundenen DNA-Fragmente mit RBP2 Antikörper immunpräzipitiert. (P3) Als nächstes werden die wiederhergestellten DNA-Fragmente an den Enden repariert und Adapter sind an den Enden der genomischen DNA ligiert, um Bibliotheken von genomischer DNA für die Analyse vorzubereiten auf die Strömung Zellen in der Illumina Cluster Station. Die DNA-Bibliotheken sind durch PCR mit geringen Anzahl von Zyklen amplifiziert. (P4) Schließlich liest Illumina sequenziert kurz sind eindeutig auf das menschliche Genom ausgerichtet ist, sind signifikante Peaks identifiziert und mit Anmerkungen versehen, um die nächste Gene, um RBP2 bereichert Regionen zu identifizieren. (P5) Ergebnisse erzielt, die zeigen, molekularen Funktionen mit RBP2 Zielgene auf genomweite Identifizierung RBP2 bereichert Regionen basieren verbunden.
Abbildung 2. Überprüfung der Ergebnisse von Chromatin Beschallung Um die Größe der DNA-Fragmente durch die Beschallung Verfahren hergestellt zu überprüfen, wurde 5 ug (10.1) des gereinigten Eingang Probe auf 1,8% Agarosegel aufgetragen. Wie erwartet, produziert unser Beschallung Verfahren Fragmente im Bereich von 150-350 bp. Allerdings, wenn die Fragmente nicht in diesem Bereich fallen, sollte die Beschallung Verfahren entsprechend angepasst werden, indem die Anzahl der Bursts und die Amplitude.
Abbildung 3. Gel Reinigung der amplifizierten Produkte. Die PCR-Produkte werden auf einem Gel laufen, um den Adapter zu entfernen und wählen Sie eine Größe-Reihe von Vorlagen für die Cluster-Generation-Plattform. Dieses Gel zeigt, dass Fragmente im Bereich zwischen 150 und 350 Basenpaaren hergestellt wurden. Sie stellen genomische DNA-Fragmente zwischen 50 und 250 Basenpaare lang und einen Adapter. Wir Verbrauchsteuern der ausgewählten Region des Gels mit einem Skalpell. Es sollte darauf geachtet, um den Adapter-Adapter Band, die bei etwa 120 Basenpaare führt zu vermeiden.
Abbildung 4. Isoform-spezifischen Antikörper ermöglicht die Unterscheidung zwischen großen und kleinen Isoformen RBP2. RBP2 Proteinstruktur in Domain-Ansicht präsentiert. RBP2 enthält mehrere Domänen: die katalytische Histon-Demethylierung JmjC Domain und die damit verbundenen JmjN Domäne, einer trockenen Domain-fähig Sequenz-spezifische DNA-Bindung, eine C5HC2 Zinkfinger, die möglicherweise mit DNA oder anderen Proteinen, und mehrere PHD-Domänen interagieren können. Die beiden anti-RBP2 Antikörper, die zwischen RBP2 Isoformen unterscheiden können gegen die RBP2 Fragmente, die durch dicke Linien angedeutet abgeleitet.
Abbildung 5a. Übersicht der RBP2 bindenden Regionen zusammen mit Chromosom und Ensembl Gene. Genomic Koordinaten identifiziert bereichert RBP2 (alle Isoformen und große Isoform) bindenden Regionen vorgestellt Chromosom weise. Occupances von Ensembl Gene (Version 54; HG18) in den Chromosomen (Chromosom 10 in diesem Bild) sind als schwarze Balken (oben) präsentiert. Jeder RBP2 bindende Region ist als eine vertikale Linie, wo das mittlere Fenster zeigt alle RBP2 Isoformen bindenden Regionen auf Chromosom 10 vertreten, und auf der Unterseite zeigt RBP2 große Isoform bindenden Regionen. Die mittleren und unteren Platten geben Überblick über die Überschneidungen und spezifische Belegung RBP2 Isoformen auf Chromosom 10.
Abbildung 5b. Functional Bereicherung Analyse RBP2 Zielgene. Heatmap zeigt FDR korrigiert signifikant (p-Wert ≤ 0,05) angereichert GO Molecular Function Kategorien unter den Genen gebunden (am nächsten Gene an die RBP2 bindende Region) durch RBP2 (alle Großen und Ganzen Isoformen). Farben nach Rot zeigen eine hohe statistische Signifikanz zeigt gelb geringe statistische Signifikanz und Grau gibt keine statistische Signifikanz. Enrichment-Analyse zeigt die Überlappung und Isoform spezifischen molekularen Funktionen der RBP2 Zielgene.
Funktionelle Unterschiede zwischen RBP2 Isoformen sind nicht bestimmt worden. Wir haben ein umfassendes Konzept zur genomischen Regionen von RBP2 Isoformen gebunden Ermittlung und Festlegung der funktionalen Kategorien, die diese Regionen darstellen. Dies wurde durch ChIP-Seq Analyse durch bioinformatische Analyse der erhaltenen Sequenz liest, erreicht.
RBP2 modifiziert methylierte Lysinreste auf Histone. Wir fanden, dass RBP2 große Isoform die Anerkennung Modul enthält für methylierte Histon-Lysin und RBP2 kleinen Isoform fehlt diesem Modul binden an verschiedene Regionen im menschlichen Genom (Abbildung 5A). Wichtig ist, dass Isoform-spezifischen Regionen und überlappenden Regionen von Genen gehören mit unterschiedlichen molekularen Funktionen (Abbildung 5B). Zum Beispiel, "Chromatin Bindung" und "Transkriptionsfaktorbindungsstellen" Funktionen können auf Gen-Targets von RBP2 kleinen Isoform zugeschrieben werden, aber nicht von RBP2 großen Isoform (Abbildung 5B). Durch den Vergleich der tatsächlichen Gen-Sets generiert für alle Isoformen und RBP2 großen Isoform (Daten nicht gezeigt), können wir auch festlegen, ob die große Isoform ist spezifisch an bestimmte Gene rekrutiert.
Diese Arbeit wurde von 115.347-RSG-08-271 bis 01-GMC von ACS, und durch CA138631 Zuschuss von NIH unterstützt.
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