Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
כאן אנו מציגים immunoprecipitation הכרומטין (שבב) נוהל לניתוח הגנום כולו מיקום isoforms חלבונים שונים בתחום היסטון מחייב. אנו מיישמים אותו לניתוח שבב Seq לזהות מטרות demethylase היסטון KDM5A/JARID1A/RBP2.
גיוס גורמים תעתיק ו epigenetic אל המטרות שלהם היא צעד מפתח בוויסות שלהם. בהשתתפות בולטת בגיוס הם תחומים חלבון אשר נקלטות על ידי שינויים היסטון ספציפיים. תחום אחד כזה הוא homeodomain צמח (PhD), נמצא הכרומטין מחייב כמה חלבונים. RBP2 גורם epigenetic יש מספר תחומים PHD, לעומת זאת, יש להם פונקציות שונות (איור 4). בפרט, בטרמינל C-PHD תחום, נמצא היתוך RBP2 בשעור של לוקמיה אדם, נקשר trimethylated ליזין 4 ב H3 היסטון (H3K4me3) 1. תמליל המתאים איזופורם RBP2 המכיל את בטרמינל C-PHD מצטבר במהלך של בידול promonocytic, לימפומה הנגזרות, U937 תאים לתוך מונוציטים 2. בקנה אחד עם שתי קבוצות של נתונים, הגנום כולו ניתוח הראה כי התמיינות תאים U937, החלבון RBP2 מקבל מקומי לאזורים גנומית מועשר עבור H3K4me3 3. לוקליזציה של RBP2 ביעדים שלה בקורלציה עם ירידה H3K4me3 עקב פעילות RBP2 demethylase היסטון וירידה פעילות תעתיק. לעומת זאת, שני PhDs אחרים RBP2 אינם מסוגלים להיקשר H3K4me3. יש לציין כי C-PHD של הטרמינל תחום RBP2 נעדרת RBP2 קטן איזופורם 4. זה מתקבל על הדעת כי איזופורם קטן RBP2, שאין לה אינטראקציה עם H3K4me3, שונה איזופורם גדול במיקום הגנומי. ההבדל במיקום הגנומי של RBP2 isoforms עשוי להסביר המגוון שנצפתה פונקציה RBP2. באופן ספציפי, RBP2 הוא שחקן קריטי בידול הסלולר בתיווך החלבון רטינובלסטומה (PRB). בהתאם לנתונים אלה, ניתוח הקודמת הגנום כולו, ללא הבחנה בין isoforms, זיהו שתי קבוצות נפרדות של RBP2 גני מטרה: 1) גנים מחויב RBP2 באופן שאינו תלוי בידול; 2) הגנים מחויב RBP2 תוך בידול תלוי בצורה.
כדי לזהות הבדלים בין לוקליזציה isoforms הופענו הגנום כולו ניתוח על ידי מיקום Seq שבב. שימוש בנוגדנים המזהים הן RBP2 isoforms לנו ממוקמת כל RBP2 מטרות. בנוסף יש לנו רק לקשור נוגדנים גדול, לא קטן RBP2 איזופורם (איור 4). לאחר זיהוי מטרות איזופורם גדול, אפשר ואז להחסיר אותם מכל RBP2 מטרות כדי לחשוף את מטרות איזופורם קטן. נתונים אלו מראים את התרומה של תחום הכרומטין-אינטראקציה בגיוס חלבון אתרי הקישור שלו בגנום.
פרוטוקול הותאם במקור ב רן, 2001. היא מייצגת שינוי קל של הפרוטוקול על ידי אודום et al. 5 אשר ניתן למצוא בכתובת http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. טרום לחסום ומחייבת של נוגדנים חרוזים מגנטיים (יש לבצע בלילה לפני השלב הבא)
2. תא cross-linking
3. תא Sonication
4. הכרומטין immunoprecipitation
5. הגברה של הדנ"א הגנומי
6. ג'ל טיהור של מוצרי הגברה
7. נציג תוצאות
באיור 1. המטרה הכוללת של הניסוי הבא הוא לזהות מטרות הגנומי של demethylase KDM5A/JARID1A/RBP2 היסטון.
(P1) זו מושגת על ידי הכנה של הכרומטין צולבים זה sonicated לייצר שברי DNA בגודל המתאים. (P2) בשלב השני, RBP2 שברי הדנ"א כרוך הן immunoprecipitated RBP2 עם נוגדנים. (P3) הבא, שברי הדנ"א החלים מתוקנים בקצוות ומתאמי הם ligated על הקצוות של הדנ"א הגנומי להכין ספריות של הדנ"א הגנומי לניתוח על תאים הזרימה בתחנת אשכול Illumina. ספריות ה-DNA הם מוגבר על ידי ה-PCR באמצעות מספר נמוך של מחזורי. (P4) לבסוף, Illumina רצף קצר קורא מיושרים ייחודי הגנום האנושי, פסגות משמעותי מזוהים המבואר על גנים הקרובים על מנת לזהות אזורים RBP2 מועשר. (P5) תוצאות מתקבלים המראים פונקציות מולקולריות הקשורים RBP2 גני מטרה מבוסס על זיהוי גנום רחב של אזורים RBP2 מועשר.
איור 2. בדיקת התוצאות של sonication הכרומטין כדי לבדוק את הגודל של קטעי DNA המיוצר על ידי ההליך sonication, 5 מיקרוגרם (1 / 10) של המדגם קלט מטוהרים הועמס על 1.8% agarose ג'ל. כצפוי, הליך sonication שלנו מיוצר שברי בטווח של 150-350 נקודות בסיס. עם זאת, אם השברים אינם נופלים בטווח זה, ההליך sonication צריכה להיות בהתאם, על ידי שינוי מספר התפרצויות את המשרעת.
איור 3. טיהור ג'ל מוגבר של מוצרים. המוצרים PCR מנוהלות על ג'ל להסרת מתאמים בחר גודל הטווח של תבניות עבור פלטפורמת הדור מצרר. ג'ל זה מראה כי שברי בטווח בין 150 ל 350 זוגות בסיסים יוצרו. הם מייצגים קטעי הדנ"א הגנומי בין 50 ל 250 זוגות בסיסים באורך מתאם. אנחנו באזור הבלו הנבחר של ג'ל עם אזמל. יש להקפיד להימנע הלהקה מתאם, מתאם, אשר פועל כ 120 זוגות בסיסים.
איור 4. איזופורם נוגדנים ספציפיים מאפשר להבחין בין isoforms גדולים וקטנים של RBP2. RBP2 מבנה החלבון מוצג בתצוגה מושלם. RBP2 כולל תחומים שונים: קטליטי היסטון demethylation JmjC תחום הקשורים JmjN תחום, תחום צחיח מסוגל מחייב-רצף DNA מסוים, אצבע אבץ C5HC2 שעשויים פוטנציאל אינטראקציה עם דנ"א או חלבונים אחרים, וכן מספר רב של תחומים PHD. שני אנטי RBP2 נוגדנים המאפשרים הבחנה בין RBP2 isoforms נגזרו נגד RBP2 שברי מסומן על ידי קווים עבים.
איור 5 א. סקירה של RBP2 האזורים מחייב יחד עם כרומוזום וגנים Ensembl. קואורדינטות הגנום של זיהו מועשר RBP2 (כל isoforms ו איזופורם גדול) באזורים מחייב מוצגים כרומוזום חכם. Occupances של גנים Ensembl (גרסה 54; hg18) ב הכרומוזומים (כרומוזום 10 בתמונה) מוצגים כפי פסים שחורים (הפאנל העליון). כל אזור RBP2 מחייב מיוצגת כקו אנכי, כאשר הלוח המרכזי מציג את כל RBP2 isoforms האזורים מחייב על כרומוזום 10, ואת הפאנל התחתון מראה RBP2 האזורים איזופורם גדול מחייב. באמצע לוחות התחתונה לתת סקירה של חופפים התפוסה ספציפיים של RBP2 isoforms על כרומוזום 10.
איור 5 ב. ניתוח פונקציונלי של העשרה RBP2 גני מטרה. Heatmap מראה רוזוולט מתוקן באופן משמעותי (p-value ≤ 0.05) מועשר GO קטגוריות פונקציה מולקולרית בין הגנים כבול (גנים הקרובים לאזור מחייב RBP2) על ידי RBP2 (isoforms כל וגדולים). צבעים אדום עולה כלפי משמעות נתון גבוה, צהוב מציין משמעות נתון נמוך, אפור מעיד אין משמעות נתון. ניתוח העשרה מציגה את חופפים איזופורם פונקציות מולקולריות ספציפיות של RBP2 גני מטרה.
הבדלים פונקציונליים בין RBP2 isoforms טרם נקבעו. השתמשנו גישה מקיפה כדי לזהות אזורים גנומית מחויב RBP2 isoforms ולהגדיר את הקטגוריות פונקציונלי כי אזורים אלה מייצגים. זה בוצע על ידי ניתוח שבב Seq ואחריו ניתוח ביואינפורמטיקה רצף המתקבל קורא.
RBP2 משנה שאריות ליזין מפוגל על זנבות היסטון. מצאנו כי RBP2 איזופורם גדול המכיל את מודול הכרה איזופורם היסטון מפוגל קטן RBP2 ליזין שחסר זה לאגד המודול אזורים שונים בגנום האנושי (איור 5 א). חשוב לציין, איזופורם ספציפי אזורים אזורים חופפים שייכים גנים עם פונקציות מולקולריים שונים (איור 5 ב). לדוגמה, "הכרומטין מחייב" או "גורם שעתוק מחייבים" פונקציות ניתן לייחס מטרות הגן של איזופורם RBP2 קטן אך לא RBP2 איזופורם גדול (איור 5 ב). על ידי השוואת הגן בפועל קובע שנוצר עבור כל isoforms ו RBP2 איזופורם גדול (מידע לא מוצג), אנחנו יכולים גם להגדיר אם איזופורם גדול הוא גויס במיוחד כדי גנים מסוימים.
עבודה זו נתמכה על ידי 115347-RSG-08-271-01-GMC מ-ACS, ועל ידי CA138631 מענק מ-NIH.
רצפים oligonucleotide 2006 Illumina, Inc כל הזכויות שמורות.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved