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Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
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Biology
यहाँ हम जीनोम चौड़ा प्रोटीन isoforms है कि एक histone बाध्यकारी डोमेन में अलग स्थान विश्लेषण के लिए एक chromatin immunoprecipitation प्रक्रिया (चिप) प्रस्तुत कर रहे हैं. हम यह चिप Seq विश्लेषण के लिए आवेदन कर रहे हैं KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase के लक्ष्यों की पहचान.
Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.
प्रोटोकॉल मूल रूप से बी रेन, 2001 से रूपांतरित किया गया. यह Odom एट अल द्वारा प्रोटोकॉल के एक मामूली संशोधन का प्रतिनिधित्व करता है. 5 कि में पाया जा सकता http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. पूर्व ब्लॉक और एंटीबॉडी के चुंबकीय मोतियों के लिए बाध्य (अगले कदम से पहले रात के लिए प्रदर्शन करना चाहिए)
2. पार से जोड़ने सेल
3. सेल Sonication
4. Chromatin immunoprecipitation
5. जीनोमिक डीएनए के प्रवर्धन
6. प्रवर्धित उत्पादों की जेल शुद्धि
7. प्रतिनिधि परिणाम
चित्रा 1. निम्न प्रयोग के समग्र लक्ष्य KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase के जीनोमिक लक्ष्यों की पहचान है.
(P1) इस पार से जुड़े chromatin है कि उपयुक्त आकार के डीएनए टुकड़े का उत्पादन करने के लिए sonicated है की तैयारी के द्वारा हासिल की है. (P2) एक दूसरे कदम के रूप में, RBP2 बाध्य डीएनए टुकड़े RBP2 एंटीबॉडी के साथ immunoprecipitated हैं. (P3) अगला, डीएनए टुकड़े बरामद सिरों पर मरम्मत कर रहे हैं और एडेप्टर जीनोमिक डीएनए के सिरों पर ligated कर रहे हैं विश्लेषण के लिए Illumina क्लस्टर स्टेशन में प्रवाह कोशिकाओं पर जीनोमिक डीएनए के पुस्तकालयों को तैयार है. डीएनए पुस्तकालयों चक्रों की कम संख्या का उपयोग करते हुए पीसीआर से परिलक्षित कर रहे हैं. (P4) अंत में, Illumina अनुक्रम कम पढ़ता विशिष्ट मानव जीनोम के लिए गठबंधन है, महत्वपूर्ण चोटियों की पहचान कर रहे हैं और क्रम में RBP2 समृद्ध क्षेत्रों की पहचान करने के लिए निकटतम जीन एनोटेट. (P5) परिणाम प्राप्त कर रहे हैं कि आणविक RBP2 जीनोम चौड़ा RBP2 समृद्ध क्षेत्रों की पहचान पर आधारित लक्ष्य जीन के साथ जुड़े कार्यों बताते हैं.
चित्रा 2. Chromatin sonication के परिणामों की जाँच के लिए डीएनए sonication प्रक्रिया द्वारा उत्पादित टुकड़े का आकार की जाँच करें, शुद्ध इनपुट नमूने के 5 μg (1 / 10) 1.8% agarose जेल पर लोड किया गया था. जैसी उम्मीद थी, हमारे sonication प्रक्रिया 150-350 बीपी की रेंज में टुकड़े का उत्पादन किया. हालांकि, अगर टुकड़े इस श्रेणी में गिरावट नहीं है, sonication प्रक्रिया तदनुसार समायोजित किया जाना चाहिए फटने की संख्या और आयाम अलग से.
चित्रा 3. प्रवर्धित उत्पादों की जेल शुद्धि. पीसीआर उत्पादों की एक जेल पर चलाए जा रहे हैं करने के लिए एडाप्टर को हटाने और एक क्लस्टर पीढ़ी मंच के लिए टेम्पलेट्स का आकार श्रेणी का चयन करें. इस जेल से पता चलता है कि रेंज में 150 और 350 आधार जोड़े के बीच टुकड़े का उत्पादन किया गया. वे 50 और 250 की लंबाई और एक adapter में बेस जोड़े के बीच जीनोमिक डीएनए टुकड़े का प्रतिनिधित्व करते हैं. हम उत्पाद एक स्केलपेल के साथ जेल के चयनित क्षेत्र. केयर बैंड अनुकूलक अनुकूलक, जो बारे में 120 आधार जोड़े रन पर से बचने के लिया जाना चाहिए.
चित्रा 4. Isoform विशिष्ट एंटीबॉडी RBP2 के बड़े और छोटे isoforms के बीच भेद RBP2 प्रोटीन संरचना की अनुमति देता है डोमेन दृश्य में प्रस्तुत किया है. : RBP2 कई डोमेन उत्प्रेरक histone demethylation JmjC डोमेन और संबद्ध JmjN डोमेन, एक शुष्क अनुक्रम विशिष्ट डीएनए बाध्यकारी C5HC2 जस्ता उंगली है कि संभवतः डीएनए या अन्य प्रोटीन, और एकाधिक डोमेन पीएचडी के साथ बातचीत कर सकते में सक्षम डोमेन शामिल हैं. दो विरोधी RBP2 एंटीबॉडी कि RBP2 isoforms के बीच भेद अनुमति देते हैं RBP2 मोटी लाइनों द्वारा संकेत टुकड़े के खिलाफ प्राप्त किए गए.
चित्रा 5a. गुणसूत्र और Ensembl जीन के साथ साथ RBP2 बाध्यकारी क्षेत्रों के अवलोकन की पहचान समृद्ध RBP2 के जीनोमिक निर्देशांक (सभी isoforms और बड़े isoform) बाध्यकारी क्षेत्रों गुणसूत्र बुद्धिमान प्रस्तुत कर रहे हैं . Ensembl जीन की Occupances (54 संस्करण, hg18) (इस चित्र में 10 गुणसूत्र) गुणसूत्रों में काली सलाखों (शीर्ष पैनल) के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं. प्रत्येक RBP2 बाध्यकारी क्षेत्र एक खड़ी रेखा है, जहां मध्यम पैनल सभी RBP2 isoforms 10 गुणसूत्र पर बाध्यकारी क्षेत्रों से पता चलता है के रूप में प्रतिनिधित्व किया है, और वह नीचे के पैनल RBP2 बड़े isoform बाध्यकारी क्षेत्रों से पता चलता है. मध्यम और नीचे पैनलों अतिव्यापी का सिंहावलोकन और 10 गुणसूत्र पर RBP2 isoforms की विशिष्ट अधिभोग दे.
चित्रा 5 ब. RBP2 लक्ष्य जीन की कार्यात्मक संवर्धन विश्लेषण हीटमैप दिखा एफडीआर काफी सही (पी मान ≤ 0.05) समृद्ध RBP2 (सब और बड़े isoforms) से बंधे (RBP2 बाध्यकारी क्षेत्र के लिए जीन निकटतम) जीन के बीच आणविक समारोह श्रेणियों जाओ . लाल की ओर रंग उच्च आंकड़ा महत्व का संकेत मिलता है, पीला कम आंकड़ा महत्व का संकेत है, और ग्रे कोई आंकड़ा महत्व को इंगित करता है. संवर्धन विश्लेषण RBP2 लक्ष्य जीन की अतिव्यापी और isoform विशिष्ट आणविक कार्यों से पता चलता है.
RBP2 isoforms के बीच कार्यात्मक मतभेद नहीं निर्धारित किया गया है. हम एक व्यापक दृष्टिकोण का इस्तेमाल किया है जीनोमिक RBP2 isoforms द्वारा बाध्य क्षेत्रों की पहचान और परिभाषित कार्यात्मक श्रेणियों कि इन क्षेत्रों का प्रतिनिधित्व करते हैं. इस चिप Seq प्राप्त अनुक्रम के जैव सूचना विज्ञान विश्लेषण पढ़ता द्वारा पीछा विश्लेषण के द्वारा पूरा किया गया था.
RBP2 histone पूंछ पर methylated लाइसिन अवशेषों को संशोधित. हमने पाया है कि RBP2 बड़े isoform methylated histone lysine और RBP2 छोटे मानव जीनोम (चित्रा 5A) में विभिन्न क्षेत्रों के लिए इस मॉड्यूल बाँध कमी isoform के लिए मान्यता मॉड्यूल से युक्त है. महत्वपूर्ण बात, isoform विशिष्ट क्षेत्रों और अतिव्यापी क्षेत्रों अलग आणविक कार्यों (चित्रा 5B) के साथ जीन के हैं. उदाहरण के लिए, "chromatin बाध्यकारी" और "प्रतिलेखन कारक बाध्यकारी" कार्यों, RBP2 छोटे isoform के जीन लक्ष्य को जिम्मेदार माना जा सकता है लेकिन RBP2 बड़े नहीं isoform (चित्रा 5B). वास्तविक जीन की तुलना करके उत्पन्न सेट सभी isoforms और RBP2 बड़े isoform (नहीं दिखाया डेटा है) के लिए, हम भी परिभाषित कर सकते हैं अगर बड़े isoform विशेष रूप से कुछ जीनों के लिए भर्ती है.
इस काम के लिए 115,347-RSG-08-271 01-जीएमसी ACS से, और CA138631 द्वारा NIH से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
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