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Materials
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Biology
Qui stiamo presentando un immunoprecipitazione della cromatina (ChIP) procedura per la genoma analisi posizione di isoforme di proteine che si differenziano in un istone-dominio di legame. Lo stiamo applicando a ChIP-Seq analisi per identificare gli obiettivi del demetilasi KDM5A/JARID1A/RBP2 istoni.
Reclutamento di fattori trascrizionali ed epigenetici ai loro obiettivi è un passo fondamentale nella loro regolazione. Prominente nel reclutamento sono i domini di proteine che si legano a specifiche modificazioni degli istoni. Un dominio tale è la omeodominio pianta (PHD), che si trova in diversi cromatina proteine leganti. Il RBP2 fattore epigenetico è più domini PHD, tuttavia, essi hanno funzioni diverse (Figura 4). In particolare, il C-terminale del dominio PHD, che si trova in una fusione RBP2 oncogeno nella leucemia umana, si lega a trimetilato lisina 4 di H3 (H3K4me3) 1. La trascrizione corrispondente alla isoforma RBP2 contenente il C-terminale PHD accumula durante la differenziazione di promonocytic, linfoma di derivazione, U937 in monociti 2. Coerentemente con due serie di dati, genoma analisi ha mostrato che in cellule U937 differenziate, la proteina RBP2 viene localizzata alle regioni genomiche altamente arricchito per H3K4me3 3. Localizzazione di RBP2 ai suoi obiettivi è correlato con una diminuzione a causa di H3K4me3 RBP2 attività demetilasi istoniche e una diminuzione dell'attività trascrizionale. Al contrario, gli altri due dottorati di RBP2 non sono in grado di legare H3K4me3. In particolare, il C-terminale del dominio PHD RBP2 è assente nel RBP2 piccoli isoforma 4. È ipotizzabile che l'isoforma piccolo RBP2, a cui manca l'interazione con H3K4me3, differisce dalla isoforma più grande in posizione genomica. La differenza di posizione genomica di RBP2 isoforme potrebbe spiegare le diversità osservate in RBP2 funzione. In particolare, RBP2 è un giocatore fondamentale nella differenziazione cellulare mediata dalla proteina retinoblastoma (pRB). Coerentemente con questi dati, precedenti analisi genome-wide, senza distinzione tra isoforme, identificati due gruppi distinti di RBP2 geni bersaglio: 1) i geni legati da RBP2 in un modo che è indipendente dalla differenziazione; 2) i geni legati da RBP2 in una differenziazione- modo dipendente.
Per identificare le differenze nella localizzazione tra le isoforme abbiamo effettuato analisi genome-wide posizione di Chip-Seq. Utilizzando anticorpi che rilevano entrambe le isoforme RBP2 abbiamo localizzato tutti RBP2 obiettivi. Inoltre abbiamo gli anticorpi che si legano solo di grandi dimensioni, e non piccolo RBP2 isoforma (Figura 4). Dopo aver identificato gli obiettivi isoforma di grandi dimensioni, si può poi sottrarre da tutte le RBP2 obiettivi per rivelare gli obiettivi della isoforma di piccole dimensioni. Questi dati mostrano il contributo della cromatina interagenti dominio nel reclutamento di proteine per la sua siti di legame nel genoma.
Il protocollo è stato originariamente adattato da B. Ren, 2001. Esso rappresenta una leggera modifica del protocollo da parte Odom et al. 5 che sono disponibili all'indirizzo http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Pre-blocco e vincolante di anticorpi sfere magnetiche (deve essere eseguita la sera prima del punto successivo)
2. Cellula di cross-linking
3. Cellula sonicazione
4. Immunoprecipitazione della cromatina
5. Amplificazione del DNA genomico
6. Purificazione gel di prodotti amplificati
7. Rappresentante Risultati
Figura 1. L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di identificare bersagli genomici di KDM5A/JARID1A/RBP2 demetilasi istoni.
(P1) Questo risultato è ottenuto dalla preparazione di cross-linked cromatina che è sonicato per la produzione di frammenti di DNA di dimensioni adeguate. (P2) In una seconda fase, RBP2 frammenti di DNA legato RBP2 sono immunoprecipitati con anticorpi. (P3) Successivamente, i frammenti di DNA recuperato vengono riparati alle estremità e gli adattatori sono legatura alle estremità del DNA genomico per preparare librerie di DNA genomico per l'analisi sulle cellule del flusso nella stazione Cluster Illumina. Le librerie di DNA sono amplificati mediante PCR utilizzando basso numero di cicli. (P4), infine, illumina in sequenza breve legge sono unicamente allineati al genoma umano, picchi significativi sono identificati e annotati al più vicino geni in modo da identificare RBP2 regioni arricchito. (P5) i risultati sono ottenuti che mostrano le funzioni molecolari associati RBP2 geni bersaglio sulla base genoma identificazione di RBP2 regioni arricchito.
Figura 2. Verifica dei risultati di sonicazione cromatina Per controllare le dimensioni dei frammenti di DNA prodotti dalla procedura di sonicazione, 5 mg (1 / 10) del campione in ingresso purificato è stato caricato su gel di agarosio 1,8%. Come previsto, la nostra procedura di sonicazione prodotta frammenti nel range di 150-350 bp. Tuttavia, se i frammenti non rientrano in questo intervallo, la procedura di sonicazione deve essere adeguato di conseguenza, variando il numero di scoppi e l'ampiezza.
Figura 3. Purificazione gel di prodotti amplificati. I prodotti della PCR vengono eseguiti su un gel per rimuovere gli adattatori e selezionare un intervallo di dimensioni di template per la piattaforma generazione cluster. Questo gel mostra che i frammenti nel range tra 150 e 350 paia di basi sono state prodotte. Essi rappresentano frammenti di DNA genomico tra 50 e 250 paia di basi di lunghezza e un adattatore. Noi accise della regione selezionata del gel con un bisturi. Si deve prestare attenzione per evitare l'adattatore adattatore fascia, che corre a circa 120 paia di basi.
Figura 4. Isoforma-specifici anticorpi isoforme permette di distinguere tra grandi e piccoli di RBP2. RBP2 struttura della proteina è presentata in vista del dominio. RBP2 contiene numerosi domini: il catalizzatore degli istoni demetilazione JmjC dominio e associati JmjN dominio, un dominio ARIDE capace di sequenza-specifico legame con il DNA, un dito di zinco C5HC2 che potenzialmente possono interagire con il DNA o di altre proteine, e più domini PHD. I due anti-RBP2 anticorpi che permettono di distinguere tra RBP2 isoforme sono stati ottenuti contro i RBP2 frammenti indicata da linee spesse.
Figura 5 bis. Panoramica delle regioni RBP2 vincolante insieme dei cromosomi e geni Ensembl. Coordinate genomiche dei identificato arricchito RBP2 (tutte le isoforme e isoforma grandi) le regioni vincolanti sono presentati cromosoma saggio. Occupances di geni Ensembl (versione 54; hg18) nei cromosomi (cromosoma 10 in questa foto) si presentano come bande nere (pannello superiore). Ogni regione RBP2 legame è rappresentato come una linea verticale, in cui il pannello centrale mostra tutte le isoforme RBP2 regioni vincolante sul cromosoma 10, e il pannello inferiore mostra RBP2 regioni isoforma grandi vincolanti. La parte centrale e dei pannelli in basso danno panoramica di sovrapposizione e di occupazione specifico di RBP2 isoforme sul cromosoma 10.
Figura 5b. Analisi di arricchimento funzionale di RBP2 geni bersaglio. Heatmap mostrando FDR corretto in modo significativo (p-value ≤ 0,05) arricchito GO categorie Funzione molecolare tra i geni legati (più vicini i geni per la regione RBP2 vincolante) da RBP2 (isoforme tutti e grande). Colori verso il rosso indicano alto significato statistico, giallo indica scarsa importanza statistica, e grigio indica alcuna rilevanza statistica. Analisi di arricchimento mostra le funzioni specifiche sovrapposizioni e isoforma molecolare di RBP2 geni bersaglio.
Differenze funzionali tra isoforme RBP2 non sono stati determinati. Abbiamo usato un approccio globale per identificare regioni genomiche vincolato da RBP2 isoforme e definire le categorie funzionali che queste regioni rappresentano. Ciò è stato realizzato da Chip-Seq analisi seguita da analisi bioinformatica di sequenze ottenute legge.
RBP2 modifica metilato residui di lisina in code degli istoni. Abbiamo scoperto che RBP2 isoforma grande contenente il modulo di riconoscimento per metilata dell'istone isoforma lisina e RBP2 piccoli privi di questo modulo si legano alle diverse regioni nel genoma umano (Figura 5A). Importante, isoforma-specifici e regioni sovrapposte appartengono a geni con diverse funzioni molecolare (Figura 5B). Ad esempio, "cromatina vincolante" e "fattore di trascrizione vincolante" funzioni possono essere attribuite agli obiettivi gene di RBP2 isoforma piccola ma non di RBP2 isoforma di grandi dimensioni (Figura 5B). Confrontando gene attuale set generati per tutte le isoforme e RBP2 isoforma di grandi dimensioni (dati non riportati), si può anche definire se l'isoforma di grandi dimensioni è specificamente reclutato alcuni geni.
Questo lavoro è stato supportato da 115.347-RSG-08-271-01-GMC da ACS, e da CA138631 borsa di studio NIH.
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