Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
여기서 우리는 히스톤 바인딩 도메인에 차이가 단백질 isoforms의 게놈 차원 위치 분석을 위해 염색질의 immunoprecipitation (칩) 프로 시저를 발표하고 있습니다. 우리는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 목표물을 식별 칩 Seq 분석에 적용됩니다.
자신의 목표를 transcriptional 및 epigenetic 요인 모집들은 규제에서 중요한 단계입니다. 눈에 띄게 특정 히스톤 수정에 바인딩 단백질 도메인은 채용에 등장. 그 중 하나가 도메인을 여러 염색질 결합 단백질에있는 공장 homeodomain (PHD)입니다. epigenetic 계수 RBP2 여러 박사 도메인을 가지고 있지만, 그들은 다른 기능 (그림 4)가. 특히, 인간의 백혈병에 RBP2 종양 발생 융합에있는 C - 터미널 PHD 도메인, 히스톤 H3 (H3K4me3) 1 리신 4 trimethylated에 바인딩합니다. C - 터미널 박사 학위를 포함하는 RBP2의 이소형에 해당하는 성적표는 monocytes이에 promonocytic, 림프종 - 유래, U937 세포의 분화 동안 축적. 데이터의 두 집합과 일치, 게놈 차원의 분석은 차별화된 U937 세포에 RBP2 단백질이 높은 H3K4me3 3에 대한 풍부한 게놈 지역에 현지 도착 것으로 나타났다. 그 목표를 RBP2의 지방화는 RBP2 히스톤 demethylase 활동 및 transcriptional 활동의 감소로 인해 H3K4me3의 감소로 연결합니다. 대조적으로, RBP2의 다른 두 박사 학위가 H3K4me3를 바인딩할 수 없습니다. 특히, RBP2의 C - 터미널 도메인 PHD는 작은 RBP2 이소형 4 결석입니다. 그것은 H3K4me3와 상호 작용을 결여 RBP2,의 작은 이소형가 게놈 위치에 더 큰 이소형 다릅니다 것을 알았기 때문에. RBP2 isoforms의 게놈 위치에 차이는 RBP2 함수에서 관찰된 다양성에 대한 계정 수 있습니다. 특히, RBP2는 retinoblastoma 단백질 (PRB)에 의해 매개 세포 분화에 중요한 선수이다. ;에 RBP2에 의해 바운드 2) 유전자 차별 - 1) 분화의 독립적인 방식으로 RBP2 구속 유전자 : isoforms 사이의 구별없이 이러한 데이터 이전 게놈 차원의 분석과 일치 RBP2 대상 유전자의 서로 다른 두 그룹을 식별 종속 방식.
isoforms 사이의 로컬 리 제이션의 차이를 확인하려면 우리는 칩 Seq하여 게놈 차원 위치 분석 수행. 우리 모두가 RBP2 대상을 찾았습니다 모두 RBP2 isoforms을 탐지 항체를 사용하여. 또한 우리는 크고 작은하지 RBP2 이소형 (그림 4) 바인딩 항체 있습니다. 대형 이소형 대상을 식별하는 한, 그 다음 작은 이소형의 목표를 밝혀 모든 RBP2 대상에서 그들을 빼야 수 있습니다. 이러한 데이터는 게놈에서의 바인딩 사이트에 단백질 모집에 염색질 - 상호 작용하는 도메인의 기여를 보여줍니다.
프로토콜은 원래 B. 랜, 2001 적응했다. 그것은 오돔 외하여 프로토콜의 약간의 수정을 나타냅니다.에서 찾을 수 있습니다 5 http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. 사전 차단하고 자석 구슬에 항체의 바인딩은 (다음 단계 전에 밤에 수행되어야 함)
2. 셀 교차 연결
3. 셀 Sonication
4. 염색질 Immunoprecipitation
5. 게놈 DNA의 증폭
6. 증폭 제품의 젤 정화
7. 대표 결과
그림 1. 다음과 같은 실험의 전반적인 목표는 KDM5A/JARID1A/RBP2 히스톤 demethylase의 게놈 목표를 식별하는 것입니다.
(P1)이 적절한 크기의 DNA 조각을 만들어 sonicated됩니다 교차 연결된 염색질의 준비에 의해 이루어진다. (P2) 두 번째 단계로서, RBP2 바운드 DNA 조각은 RBP2 항체와 immunoprecipitated 있습니다. (P3) 다음, 복구 DNA 조각은 끝에 수리하고 어댑터 Illumina 클러스터 역의 흐름 세포에 대한 분석을 위해 게놈 DNA의 라이브러리를 준비하는 게놈 DNA의 끝부분에 출혈도 잡았 있습니다. DNA 라이브러리는 사이클의 낮은 번호를 사용하여 PCR로 증폭됩니다. (P4) 마지막으로, illumina 합성 짧은 고유 인간 게놈에 정렬됩니다 읽고, 중요한 봉우리는 RBP2 풍부한 지역을 파악하기 위해 식별과 가장 가까운 유전자에 주석 있습니다. (P5) 결과는 RBP2 풍부한 지역의 게놈 전체의 신분에 따라 RBP2 대상 유전자와 연관된 분자 기능을 보여줄 것을 얻을 수 있습니다.
그림 2. sonication 절차에 의해 만들어진 DNA 조각의 크기를 확인하려면 염색질 sonication의 결과를 확인, 정화 입력 샘플 5 μg (1 / 10) 1.8 % 아가로 오스 겔에 적재가되었던 것. 예상했던대로, 우리 sonication 절차 150-350 BP의 범위에서 조각을 생산. 조각이 범위에 빠지지하지 않은 경우 단, sonication 절차는 파열과 진폭의 수를 변화에 의해 적절하게 조정해야합니다.
그림 3. 증폭 제품의 젤 정화가. PCR 제품은 어댑터를 제거하고 클러스터 세대 플랫폼에 템플릿의 크기 범위를 선택하는 젤에서 실행됩니다. 이 젤 150 및 350 기본 쌍 사이의 범위에서 조각이 생성 것을 나타냅니다. 그들은 길이와 어댑터에서 50 250 기본 쌍 사이의 게놈의 DNA 조각을 나타냅니다. 메스로 젤의 우리는 소비세 선택한 영역. 치료는 약 120 기본 쌍에서 실행 어댑터 어댑터 밴드를 피하기 위해 이동해야합니다.
그림 4. 이소형 특정 항체는 RBP2의 크고 작은 isoforms 구별하실 수 있습니다. RBP2 단백질 구조가 도메인보기에 표시됩니다. 촉매 히스톤 demethylation JmjC 도메인과 관련된 JmjN 도메인 시퀀스 특정 DNA 바인딩, 잠재적으로 DNA 또는 기타 단백질, 여러 박사 도메인과 상호 작용 수있는 C5HC2 아연 손가락 가능한 건조한 도메인 : RBP2 여러 도메인을 포함하고 있습니다. RBP2 isoforms 구별 수 있도록 두 가지 안티 RBP2 항체는 굵은 선으로 표시된 RBP2 조각에 대한 파생되었습니다.
그림 5A. 염색체와 유전자 Ensembl와 함께 RBP2 바인딩 지역의 개요. 확인된 풍부한 RBP2의 게놈 좌표가 (모든 isoforms 및 대형 이소형) 바인딩 지역 염색체가 현명 제공됩니다. Ensembl 유전자의 Occupances (버전 54, hg18) 염색체에있는가 (이 그림에서 염색체 10) 검은 바 (맨 위 패널)로 제공됩니다. 각 RBP2 바인딩 지역은 중앙 패널은 모든 RBP2 isoforms에게 염색체 10 일 구속 지역을 표시하는 수직선,로 표시하고, 하단 패널 RBP2 대형 이소형 바인딩 영역을 표시합니다. 중간과 하단 패널은 중복의 개요 및 염색체 10 RBP2 isoforms의 특정 숙박을 제공합니다.
그림 5B. RBP2 대상 유전자의 기능 강화 분석. 히트맵 FDR을 보여주는 풍부한는 RBP2 (모든 대형 isoforms)의 (RBP2 바인딩 영역에 유전자를 가장 가까운) 바운드 유전자 간의 분자 기능 범주를 GO (P - 값 ≤ 0.05) 대폭 수정. 붉은 방향으로 색상이 높은 통계 중요성을 나타내는 노란색이 낮은 통계 중요성을 나타냅니다, 그리고 회색은 통계 중요성을 나타냅니다 없습니다. 농축 분석 RBP2 대상 유전자의 중복과 이소형 특정 분자 기능을 보여줍니다.
RBP2 isoforms 사이의 기능적 차이는 결정되지 않았습니다. 우리는 RBP2 isoforms에 의해 바운드 게놈 영역을 파악하고이 지역이 대표하는 기능 범주를 정의하는 종합적인 접근 방식을 사용했습니다. 이것은 얻은 일련의 생물 정보학 분석을 읽은 다음에 칩 Seq 분석에 의해 성취되었다.
RBP2는 히스톤 꼬리에 methylated 리신 잔류물을 수정합니다. 우리는 RBP2 큰 이소형은 인간의 게놈 (그림 5A)의 다른 지역이 모듈 바인딩 부족 methylated 히스톤 라이신과 RBP2 작은 이소형에 대한 인식 모듈을 포함하는 것으로 나타났습니다. 중요한 것은, 이소형 특정 지역 및 중복 지역은 다른 분자 기능 (그림 5B)와 유전자에 속합니다. 예를 들어, "염색질 결합"및 "전사 인자 바인딩"기능은 RBP2 작은 이소형의 유전자 표적 관찰 작용의 수 있지만하지 RBP2 대형 이소형 (그림 5B). 실제 유전자를 비교하여 큰 이소형가 특별히 특정 유전자에 모집하는 경우에는 모든 isoforms 및 RBP2 대형 이소형 (데이터가 표시되지 않음)에 대해, 우리도 정의할 수 있습니다 생성 설정합니다.
이 작품은 NIH에서 115,347 - RSG - 08-271 - 01 - GMC ACS에서, 그리고 CA138631에 의해 부여에 의해 지원되었다.
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