Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Aqui estamos apresentando uma imunoprecipitação da cromatina (CHIP) procedimento para análise do genoma localização das isoformas de proteínas que diferem em um domínio de ligação de histonas. Estamos aplicando-a-CHIP Seq análise para identificar os alvos da demetilase KDM5A/JARID1A/RBP2 histonas.
Recrutamento de fatores de transcrição e epigenéticos para as suas metas é um passo fundamental na sua regulamentação. Em lugar de destaque no recrutamento são os domínios de proteínas que se ligam a determinadas modificações das histonas. Um domínio como é o homeodomínio planta (PHD), encontrado em várias proteínas de ligação da cromatina. O RBP2 fator epigenético tem vários domínios PHD, no entanto, eles têm funções diferentes (Figura 4). Em particular, o C-terminal PHD domínio, encontrado em uma fusão RBP2 oncogênico em leucemia humana, liga-se a lisina trimethylated 4 em H3 histonas (H3K4me3) 1. A transcrição correspondente à isoforma RBP2 contendo o PHD C-terminal se acumula durante a diferenciação de promonocytic, linfoma derivados, U937 células em monócitos 2. Consistente com ambos os conjuntos de dados, análise do genoma mostrou que em células U937 diferenciada, a proteína RBP2 é localizado para regiões genômicas altamente enriquecido para H3K4me3 3. Localização de suas metas para RBP2 correlaciona-se com uma diminuição na H3K4me3 devido à atividade RBP2 demetilase histona e uma diminuição da atividade transcricional. Em contraste, dois outros RBP2 DPSs são incapazes de vincular H3K4me3. Notavelmente, o C-terminal do domínio de PHD RBP2 está ausente no menor RBP2 isoforma 4. É concebível que a isoforma pequeno de RBP2, que carece de interação com H3K4me3, difere da maior isoforma na localização genômica. A diferença na localização genômica de RBP2 isoformas pode explicar a diversidade observada em RBP2 função. Especificamente, RBP2 é um jogador fundamental na diferenciação celular mediada pela proteína retinoblastoma (pRB). Consistente com esses dados, a análise do genoma anterior, sem distinção entre as isoformas, identificou dois grupos distintos de genes RBP2 alvo: 1) genes vinculados por RBP2 de uma forma que é independente de diferenciação; 2) genes vinculados por RBP2 em uma diferenciação forma dependente.
Para identificar diferenças na localização entre as isoformas realizamos genome-wide análise de localização por Chip Seq. Utilizando anticorpos que detectam tanto RBP2 isoformas temos localizado todos os RBP2 alvos. Além disso, temos anticorpos que se ligam apenas grande, e não pequeno RBP2 isoforma (Figura 4). Depois de identificar os alvos isoforma de grande porte, pode-se então subtrair-los de todos os RBP2 alvos para revelar as metas da isoforma de pequeno porte. Esses dados mostram a contribuição de cromatina interagindo domínio no recrutamento de proteínas para seus sítios de ligação no genoma.
O protocolo foi originalmente adaptado do B. Ren, 2001. Ela representa uma ligeira modificação do protocolo por Odom et al. 5 que podem ser encontradas em http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Pré-bloco e ligação de anticorpos para esferas magnéticas (Deve ser realizada na noite anterior próximo passo)
2. Célula cross-linking
3. Sonication celular
4. Cromatina Imunoprecipitação
5. Amplificação do DNA genômico
6. Gel de purificação dos produtos amplificados
7. Resultados representante
Figura 1. O objetivo geral do experimento seguinte é identificar alvos genoma de KDM5A/JARID1A/RBP2 demetilase histonas.
(P1) Isto é conseguido pela preparação de cross-linked cromatina que é sonicado para produzir fragmentos de DNA de tamanho apropriado. (P2) Como segundo passo, RBP2 fragmentos de DNA ligados são immunoprecipitated com RBP2 anticorpos. (P3) Em seguida, os fragmentos de DNA recuperado são reparados nas extremidades e adaptadores são ligados nas extremidades do DNA genômico para preparar bibliotecas de DNA genômico para análise sobre as células de fluxo na Estação Cluster Illumina. As bibliotecas de DNA são amplificados por PCR usando baixo número de ciclos. (P4) Por fim, Illumina seqüenciados curto lê são exclusivamente alinhados ao genoma humano, picos significativos são identificados e anotados para o próximo genes a fim de identificar RBP2 regiões enriquecido. (P5) Os resultados são obtidos que mostram funções moleculares associados com RBP2 genes alvo com base no genoma de identificação de regiões RBP2 enriquecido.
Figura 2. Verificar os resultados de sonicação cromatina Para verificar os tamanhos dos fragmentos de DNA produzidos pelo processo de sonicação, 5 mg (1 / 10) da amostra de entrada purificada foi carregado em 1,8% agarose gel. Como esperado, o nosso procedimento de sonicação produzido fragmentos na faixa de 150-350 bp. No entanto, se os fragmentos não se enquadram nesta faixa, o procedimento de sonicação deve ser ajustada em conformidade, variando o número de rajadas ea amplitude.
Figura 3. Gel de purificação dos produtos amplificados. Os produtos de PCR são executados em um gel para remover os adaptadores e selecione um tamanho gama de modelos para a plataforma de geração de cluster. Este gel mostra que fragmentos na faixa entre 150 e 350 pares de base foram produzidos. Eles representam fragmentos de DNA genômico entre 50 e 250 pares de bases de comprimento e um adaptador. Nós a região selecionada consumo de gel com um bisturi. Cuidados devem ser tomados para evitar a banda adaptador adaptador, que roda a cerca de 120 pares de bases.
Figura 4. Isoforma específica de anticorpos permite distinguir entre grandes e pequenos isoformas de RBP2. RBP2 estrutura da proteína é apresentado na vista de domínio. RBP2 contém vários domínios: o catalisador da histona desmetilação JmjC domínio e associados JmjN domínio, um domínio ÁRIDO capaz de sequências específicas de DNA de ligação, um dedo de zinco C5HC2 que potencialmente podem interagir com DNA ou outras proteínas, e vários domínios PHD. Os dois anticorpos anti-RBP2 que permitem distinguir entre RBP2 isoformas foram obtidos contra o RBP2 fragmentos indicadas por linhas grossas.
Figura 5a. Visão geral do RBP2 regiões de ligação junto com cromossomos e genes Ensembl. Coordenadas de Genomic identificados enriquecido RBP2 (todas as isoformas e isoforma grande) regiões de ligação são apresentados cromossomo sábio. Occupances de genes Ensembl (versão 54; hg18) nos cromossomos (cromossomo 10 na foto) são apresentados como barras pretas (painel superior). Cada região RBP2 ligação é representada como uma linha vertical, onde o painel do meio mostra todas as isoformas RBP2 regiões de ligação no cromossomo 10, eo painel inferior mostra RBP2 regiões isoforma grande ligação. Meio e painéis de fundo dar visão geral de sobreposição e de ocupação específico de RBP2 isoformas no cromossomo 10.
Figura 5b. Análise funcional de enriquecimento RBP2 genes-alvo. Mapa de calor mostrando FDR corrigido significativamente (p ≤ 0,05) enriquecido GO categorias Função Molecular entre os genes ligados (o mais próximo genes para a região RBP2 ligação) por RBP2 (isoformas todos e grande). As cores para vermelho indicam alta significância estatística, amarelo indica significância estatística baixa, e cinza indica que não há significância estatística. Análise de enriquecimento mostra a sobreposição de funções específicas e isoforma molecular dos genes RBP2 alvo.
Diferenças funcionais entre RBP2 isoformas não foram determinadas. Temos usado uma abordagem abrangente para identificar regiões genômicas vinculado por RBP2 isoformas e definir as categorias funcionais que estas regiões representam. Isto foi conseguido por Chip-Seq análise bioinformática seguido por análise de seqüência obtida lê.
RBP2 modifica metilado resíduos de lisina nas caudas das histonas. Descobrimos que RBP2 isoforma grandes contendo o módulo de reconhecimento de metilado isoforma lisina e RBP2 histona pequena sem este módulo para ligar as diferentes regiões do genoma humano (Figura 5A). Importante, isoforma específica regiões e regiões sobrepostas pertencem a genes com funções diferentes molecular (Figura 5B). Por exemplo, "cromatina obrigatório" e "fator de transcrição de ligação" funções podem ser atribuídas a metas de gene da isoforma RBP2 pequeno, mas não de grande RBP2 isoforma (Figura 5B). Comparando gene real conjuntos gerados para todas as isoformas e RBP2 isoforma grande (dados não mostrados), também podemos definir se a isoforma grande é especificamente recrutados para determinados genes.
Este trabalho foi financiado pelo 115.347-RSG-08-271-01-GMC da ACS, e por CA138631 concessão do NIH.
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