Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Здесь мы представляем иммунопреципитации хроматина (чип) процедура генома расположение анализ изоформ белков, отличающихся по гистонов-связывающий домен. Мы применяем его к чипу-Seq анализ, чтобы определить цели KDM5A/JARID1A/RBP2 гистонов деметилазы.
Набор транскрипции и эпигенетических факторов к своим целям является ключевым шагом в их регулировании. Видное место при приеме на работу являются белковых доменов, которые связываются с конкретной модификации гистонов. Один из таких областей завод homeodomain (PHD), найденный в нескольких хроматина белки. Эпигенетические RBP2 фактор состоит из нескольких доменов PHD, однако, они имеют разные функции (рис. 4). В частности, С-концевой домен PHD, найденный в RBP2 онкогенных синтеза в лейкемии человека, связывается с trimethylated лизина 4 в гистона H3 (H3K4me3) 1. Стенограмма соответствующие изоформы RBP2 содержащих С-концевой PHD накапливается при дифференциации promonocytic, лимфома происхождения, U937 клеток в моноциты 2. В соответствии с обоих наборов данных, генома анализ показал, что в дифференцированных клетках U937, белка RBP2 получает локализован в геномных регионов обогащенного для H3K4me3 3. Локализация RBP2 своей цели коррелирует с уменьшением H3K4me3 из-за RBP2 гистонов деятельности деметилазы и снижение транскрипционной активности. В отличие от двух других кандидатов наук из RBP2 не в состоянии связать H3K4me3. Примечательно, что С-концевой домен кандидат RBP2 отсутствует в меньшей RBP2 изоформы 4. Вполне возможно, что небольшие изоформы RBP2, которому не хватает взаимодействия с H3K4me3, отличается от большей изоформы в геномных месте. Разница в геномных расположение RBP2 изоформ может быть причиной наблюдаемого многообразия в RBP2 функции. В частности, RBP2 является важнейшим игроком в клеточной дифференцировки посредничестве белок ретинобластомы (PRB). В соответствии с этими данными, предыдущие генома анализа, без различия между изоформ, определены две различные группы RBP2 генов-мишеней: 1) гены связаны RBP2 в манере, которая не зависит от дифференциации, 2) гены связаны RBP2 в дифференциации- зависимым образом.
Чтобы выявить различия в локализации между изоформ мы провели генома анализ местоположения, ChIP-Seq. Использование антител, которые обнаруживать как RBP2 изоформ мы расположены все RBP2 целей. Кроме того, мы антитела, которые связываются только большой, и не малые RBP2 изоформы (рис. 4). После выявления крупных целей изоформы, можно затем вычесть их из всех RBP2 цели выявить цели малых изоформ. Эти данные показывают, вклад хроматина взаимодействующих домена белка вербовки в свои сайты связывания в геноме.
Протокол был изначально адаптирована из B. Ren, 2001. Она представляет собой небольшую модификацию протокола Одом и соавт. 5 видно, что можно найти на http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Предварительно блок и связывание антител к магнитных шариков (должен быть выполнен в ночь перед следующему шагу)
2. Сотовые сшивания
3. Сотовые ультразвуком
4. Хроматин Иммунопреципитация
5. Усиление геномной ДНК
6. Гель очистки амплифицированных продуктов
7. Представитель Результаты
Рисунок 1. Общая цель следующего эксперимента является определение геномной целей KDM5A/JARID1A/RBP2 гистонов деметилазы.
(P1) Это достигается за счет подготовки сшитого хроматина, который обрабатывали ультразвуком, чтобы произвести фрагменты ДНК соответствующего размера. (P2) В качестве второго шага, RBP2 связаны фрагменты ДНК иммунопреципитации с RBP2 антител. (P3) Далее, восстановленные фрагменты ДНК отремонтировано на концах и адаптеры лигировали на концы геномной ДНК, чтобы подготовить библиотеки геномной ДНК для анализа на потоке клеток в Illumina станции кластера. ДНК библиотек усиливаются методом ПЦР с использованием небольшого числа циклов. (Р4), наконец, освещения последовательность коротких чтение однозначно увязаны с геномом человека, значимых пиков определены и аннотированный до ближайшего генов с целью выявления RBP2 обогащенного регионах. (С-5) Получены результаты, которые показывают молекулярно функций, связанных с RBP2 генов-мишеней на основе генома идентификации RBP2 области, обогащенные.
Рисунок 2. Проверка результатов хроматина ультразвуком Для проверки размеров фрагментов ДНК производится путем обработки ультразвуком процедуры, 5 мкг (1 / 10) очищенный входной образец был погружен на 1,8% агарозном геле. Как и ожидалось, наша процедура производится ультразвуком фрагментов в диапазоне 150-350 б.п.. Однако, если фрагменты не находятся в этом диапазоне, ультразвука процедура должна быть соответствующим образом скорректированы, варьируя число всплесков и амплитудой.
Рисунок 3. Гель очистки усиленный продукции. ПЦР-продукты работают на гель для удаления адаптеры и выберите размер дальности шаблонов для платформы поколения кластера. Этот гель показывает, что фрагменты в диапазоне между 150 и 350 пар оснований, были произведены. Они представляют геномных фрагментов ДНК от 50 до 250 пар оснований в длину и адаптер. Мы акцизного выбранного региона геля с помощью скальпеля. Следует проявлять осторожность, чтобы избежать адаптер-переходник группа, которая работает на частоте около 120 пар оснований.
Рисунок 4. Изоформы-специфических антител позволяет различия между большими и малыми изоформы RBP2. RBP2 структуры белка представлен в доменном представлении. RBP2 содержит несколько доменов: каталитическая гистонов деметилирования JmjC домен и связанные с ними JmjN домена, домен АРИДНЫХ способны последовательности конкретных обязательных ДНК, C5HC2 пальцем цинка, которые потенциально могут взаимодействовать с ДНК или других белков, и несколько доменов PHD. Два противотанковых RBP2 антитела, которые позволяют различия между RBP2 изоформы были получены от RBP2 фрагменты указанных жирными линиями.
На рисунке 5а. Обзор RBP2 обязательным регионов вместе с хромосомой и Ensembl генов. Геномная координаты определены обогащенного RBP2 (все изоформы и крупные изоформы) связывание регионам представлены хромосомы мудрым. Occupances из Ensembl генов (версия 54; hg18) в хромосомы (хромосомы 10 в этой картине) представлены в виде черных полос (верхняя часть). Каждый RBP2 связывающей области представляется в виде вертикальной линии, где средняя панель показывает все RBP2 изоформ обязательным регионов на хромосоме 10, а нижняя панель показывает RBP2 большой изоформы обязательным регионах. Средней и нижней панели дают обзор перекрытия и конкретные занятость RBP2 изоформ на хромосоме 10.
На рисунке 5б. Функциональный анализ обогащения RBP2 генов-мишеней. Тепловая карта показывает FDR исправлены достоверно (р-значение ≤ 0,05) обогащенного GO молекулярной категорий Функция среди генов связаны (ближайший гены RBP2 обязательным область) RBP2 (все и крупных изоформ). Цвета к красным, указывают на высокую значимость статистики, желтый указывает на низкий значение статистики, и серый указывает на отсутствие статистики значение. Обогащение анализ показывает, перекрытия и изоформы конкретные молекулярные функции RBP2 генов-мишеней.
Функциональные различия между RBP2 изоформ не были определены. Мы использовали комплексный подход для выявления генома связаны RBP2 изоформ и определить функциональные категории, что эти области представляют. Это было достигнуто путем ChIP-Seq анализа следует биоинформатики анализ полученной последовательности чтения.
RBP2 модифицирует метилированный остатков лизина на гистоновых хвостов. Мы обнаружили, что большая RBP2 изоформы содержащие признание модуль для метилированных гистонов лизина и RBP2 небольшой изоформы не хватает этого модуля связываются в различные регионы в геноме человека (рис. 5А). Важно отметить, что изоформы конкретные регионы и сопредельные регионы принадлежат генов с различной молекулярной функции (рис. 5B). Например, "хроматина обязательные» и «связывания транскрипционных факторов» функции могут быть приписаны гена целями RBP2 небольшой изоформы но не RBP2 большой изоформы (рис. 5B). Сравнивая фактические гена наборами, сформированными для всех изоформ и RBP2 большой изоформы (данные не представлены), мы также можем определить, если большая изоформы специально нанят для определенных генов.
Эта работа была поддержана 115347-RSG-08-271-01-GMC от ACS, а также CA138631 грант NIH.
Олигонуклеотидных последовательностей 2006 Illumina, Inc Все права защищены.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved