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Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Aquí estamos presentando una inmunoprecipitación de cromatina (CHIP) Procedimiento para el análisis de localización en todo el genoma de las isoformas de la proteína que se diferencian en un dominio de unión a las histonas. Estamos aplicando a CHIP-Seq análisis para identificar los objetivos de la histona desmetilasa KDM5A/JARID1A/RBP2.
El reclutamiento de factores de transcripción y epigenéticas de sus objetivos es un paso clave en su regulación. Un lugar destacado en la contratación son los dominios de la proteína que se unen a determinadas modificaciones de las histonas. Un dominio, es la planta de homeodominio (PHD), que se encuentra en varias proteínas de unión a la cromatina. El factor de RBP2 epigenética tiene múltiples dominios PHD, sin embargo, tienen funciones diferentes (Figura 4). En particular, el C-terminal de dominio PHD, que se encuentra en una fusión RBP2 oncogénico en la leucemia humana, se une a trimetiladas lisina 4 de la histona H3 (H3K4me3) 1. La transcripción que corresponde a la isoforma RBP2 que contiene el PHD C-terminal se acumula durante la diferenciación de promonocítica, el linfoma de origen, las células U937 en monocitos 2. De acuerdo con ambos conjuntos de datos de todo el genoma análisis mostró que en las células U937 diferenciadas, la proteína RBP2 se localiza en regiones genómicas altamente enriquecido para H3K4me3 3. Localización de RBP2 de sus objetivos se correlaciona con una disminución en H3K4me3, debido a la actividad RBP2 desmetilasa histonas y una disminución en la actividad transcripcional. Por el contrario, otros dos doctorados de RBP2 son incapaces de unirse H3K4me3. Cabe destacar que el dominio C-terminal de la PHD RBP2 está ausente en los más pequeños RBP2 isoforma 4. Es concebible que la isoforma pequeña RBP2, que carece de la interacción con H3K4me3, difiere de la isoforma más grande en la localización genómica. La diferencia en la localización genómica de RBP2 isoformas puede dar cuenta de la diversidad observada en RBP2 función. En concreto, RBP2 es un jugador fundamental en la diferenciación celular mediada por la proteína retinoblastoma (pRB). De acuerdo con estos datos, el análisis anterior, todo el genoma, sin distinción entre las isoformas, se identificaron dos grupos distintos de RBP2 genes diana: 1) los genes vinculados por RBP2 de una manera que es independiente de la diferenciación, 2) los genes vinculados por RBP2 en una diferenciación manera dependiente.
Para identificar las diferencias en la localización entre las isoformas se realizó en todo el genoma análisis de la ubicación por chip-Seq. El uso de anticuerpos que detectan tanto RBP2 isoformas se han localizado todos los RBP2 objetivos. Además tenemos los anticuerpos que se unen sólo grandes y pequeños no RBP2 isoforma (Figura 4). Después de identificar los objetivos de la isoforma grandes, uno se puede quitar de todos los RBP2 objetivos para revelar los objetivos de la isoforma pequeña. Estos datos muestran la contribución de la cromatina, la interacción de dominio en el reclutamiento de proteínas para sus sitios de unión en el genoma.
El protocolo fue adaptado originalmente de B. Ren, 2001. Que representa una ligera modificación del protocolo de Odom et al. 5, que se puede encontrar en http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Pre-bloque y la unión del anticuerpo a perlas magnéticas (En caso de llevarse a cabo la noche antes de que el siguiente paso)
2. Células de entrecruzamiento
3. Sonicación celular
4. Inmunoprecipitación de cromatina
5. Amplificación de ADN genómico
6. Gel de purificación de los productos amplificados
7. Resultados representante
Figura 1. El objetivo general de la siguiente experimento consiste en identificar los objetivos de la genómica KDM5A/JARID1A/RBP2 desmetilasa histonas.
(P1) Esto se logra mediante la preparación de enlaces cruzados de la cromatina que se somete a sonicación para producir fragmentos de ADN de tamaño apropiado. (P2) En un segundo paso, RBP2 fragmentos de ADN están obligados immunoprecipitated con RBP2 anticuerpos. (P3) A continuación, los fragmentos de ADN recuperado se reparan en los extremos y los adaptadores se ligan a los extremos de ADN genómico para preparar las bibliotecas de ADN genómico para el análisis de las células de flujo en la estación de racimo Illumina. Las bibliotecas de ADN amplificado por PCR utilizando bajo número de ciclos. (P4) Por último, Illumina secuencia corta lee son los únicos alineados con el genoma humano, los picos que se detecten y anotadas, en el más genes a fin de identificar RBP2 regiones enriquecidas. (P5) Los resultados se obtienen que muestran las funciones moleculares asociados con RBP2 genes diana sobre la base de todo el genoma de identificación de RBP2 regiones enriquecidas.
Figura 2. Comprobar los resultados de la cromatina sonicación Para comprobar el tamaño de los fragmentos de ADN producidos por el procedimiento de ultrasonidos, 5 g (1 / 10) de la muestra de entrada purificada fue cargado en un 1,8% en gel de agarosa. Como era de esperar, nuestro proceso de sonicación produjo fragmentos en el rango de 150-350 pb. Sin embargo, si los fragmentos no están en este rango, el procedimiento de ultrasonidos debe ajustarse en consecuencia, variando el número de explosiones y la amplitud.
Figura 3. Purificación en gel de los productos amplificados. Los productos de PCR se ejecutan en un gel para eliminar los adaptadores y seleccione un tamaño de gama de plantillas para la generación de plataformas de cluster. Este gel muestra que los fragmentos en el rango entre 150 y 350 pares de bases se produjeron. Que representan fragmentos de ADN genómico de entre 50 y 250 pares de bases de longitud y un adaptador. Estamos sujetos a impuestos especiales de la región seleccionada de gel con un bisturí. Se debe tener cuidado para evitar que la banda adaptador adaptador, que se cifra en unas 120 pares de bases.
Figura 4. Isoforma de anticuerpos específicos permite distinguir entre las isoformas de grandes y pequeños de RBP2. RBP2 estructura de la proteína se presenta en el punto de vista del dominio. RBP2 contiene varios dominios: el catalizador histona desmetilación JmjC dominio y asociados JmjN de dominio, un dominio de ÁRIDAS capaz de secuencia específica de unión al ADN, un dedo de zinc C5HC2 que potencialmente pueden interactuar con el ADN o las proteínas, y varios dominios PHD. Los dos anticuerpos anti-RBP2 que permiten distinguir entre RBP2 isoformas se obtuvieron en contra de la RBP2 fragmentos indicado por líneas gruesas.
Figura 5a. Resumen de RBP2 regiones de unión a lo largo de los cromosomas y los genes con Ensembl. Coordenadas de Genómica identifica enriquecida RBP2 (todas las isoformas y la isoforma de gran tamaño) se presentan regiones de unión de cromosomas sabio. Occupances de genes Ensembl (versión 54; hg18) en los cromosomas (el cromosoma 10, en esta imagen) se presentan como barras de color negro (arriba). Cada región está representada RBP2 vinculante como una línea vertical, en el panel central muestra todas las isoformas RBP2 regiones de unión en el cromosoma 10, y el panel inferior muestra RBP2 regiones isoforma vinculante grandes. El centro y los paneles inferiores con un resúmen de la superposición y la ocupación específica de RBP2 isoformas en el cromosoma 10.
Figura 5b. El análisis de enriquecimiento funcional de los genes diana RBP2. Heatmap mostrando FDR corregida de forma significativa (valor de p ≤ 0,05) enriquecido GO categorías de función molecular entre los genes vinculados (más genes de la región de unión RBP2) por RBP2 (isoformas de todos y de gran tamaño). Colores hacia el rojo indican significación estadística alta, color amarillo indica significación estadística baja, y el gris indica que no hay significación estadística. El análisis de enriquecimiento muestra la superposición de funciones específicas y la isoforma molecular de los genes diana RBP2.
Las diferencias funcionales entre las isoformas RBP2 no se han determinado. Hemos utilizado un enfoque integral para identificar las regiones genómicas obligado por RBP2 isoformas y definir las categorías funcionales que estas regiones representan. Esto se logró por chip-Seq análisis, seguidas de análisis bioinformático de la secuencia obtenida se lee.
RBP2 modifica metilado residuos de lisina en las colas de las histonas. Hemos encontrado que RBP2 isoforma grande que contiene el módulo de reconocimiento de las histonas metiladas isoforma pequeña lisina y RBP2 que carecen de este módulo se unen a las diferentes regiones en el genoma humano (Figura 5). Es importante destacar que la isoforma específica de las regiones y las regiones con áreas pertenecen a los genes con diferentes funciones moleculares (Figura 5). Por ejemplo, "la cromatina vinculante" y "factor de transcripción vinculante" se pueden atribuir a los objetivos del gen de la isoforma RBP2 pequeño, pero no de la isoforma RBP2 grandes (Figura 5). Al comparar los genes reales conjuntos generados para todas las isoformas y RBP2 isoforma de gran tamaño (datos no mostrados), también puede definir si la isoforma grande es contratado específicamente a ciertos genes.
Este trabajo fue apoyado por 115 347-RSG-08-271-01-GMC de ACS, y por CA138631 subvención de los NIH.
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