Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Här är vi presentera en kromatin immunoprecipitation (chip) Förfarandet för arvsmassan plats för hela analys av protein isoformer som skiljer sig en histon-bindande domän. Vi tillämpar den till chip-Seq analys för att identifiera målen för KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demetylas.
Rekrytering av transkription och epigenetiska faktorer för att deras mål är ett viktigt steg i deras reglering. Prominently inom rekrytering är det protein domäner som binder till specifika histon ändringar. En sådan domän är anläggningen homeodomain (PhD), finns i flera kromatin-bindande proteiner. Den epigenetiska faktorn RBP2 har flera PHD domäner, har de dock olika funktioner (Figur 4). Framför allt binder C-terminalen PHD domän, hittades i en RBP2 onkogena fusion i mänskliga leukemi, att trimethylated lysin 4 i histon H3 (H3K4me3) 1. Avskriften motsvarar RBP2 isoformen som innehåller C-terminalen PHD ackumuleras under differentiering av promonocytic, lymfom-derived, U937 celler i monocyter 2. I överensstämmelse med båda uppgifterna, visade genomet hela analysen som i differentierade U937 celler, blir RBP2 proteinet lokaliserad till genomiska regioner höganrikat för H3K4me3 3. Lokalisering av RBP2 sina mål korrelerar med en minskning av H3K4me3 grund RBP2 histon demetylas aktivitet och en minskning i transkriptionell aktivitet. Däremot två andra doktorer i RBP2 inte kan binda H3K4me3. Noterbart är C-terminal domän PHD av RBP2 frånvarande i det mindre RBP2 isoformen 4. Det är tänkbart att de små isoformen av RBP2, som saknar interaktion med H3K4me3, skiljer sig från de större isoformen i genomisk plats. Skillnaden i genomisk plats RBP2 isoformer kan svara för den observerade mångfald i RBP2 funktion. Specifikt är RBP2 en kritisk aktör i cellulär differentiering förmedlas av retinoblastom protein (PRB). I överensstämmelse med dessa uppgifter tidigare genomet hela analysen, utan åtskillnad mellan isoformer, två avgränsade grupper av RBP2 mål gener: 1) gener bunden av RBP2 på ett sätt som är oberoende av differentiering, 2) gener bunden av RBP2 i en differentiering- beroende sätt.
Att hitta skillnader i lokaliseringen mellan isoformerna vi utförde genomet plats för hela analys av Chip-Seq. Använda antikroppar som upptäcker både RBP2 isoformer vi har hittat alla RBP2 mål. Dessutom har vi antikroppar som bara binder stora och inte små RBP2 isoform (Figur 4). Efter att ha identifierat de stora isoformen målen, kan man dra dem sedan från alla RBP2 mål att avslöja att fångas med mindre isoformen. Dessa data visar bidrag kromatin-interagerande domän i proteinet rekryteringen till dess bindningsställen i arvsmassan.
Protokollet var ursprungligen anpassats från B. Ren, 2001. Det representerar en liten ändring av protokollet Odom et al. 5 som finns på http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Pre-blocket och bindning av antikroppar till magnetiska kulor (bör göras kvällen innan nästa steg)
2. Cell tvärbindning
3. Cell sonication
4. Kromatin Immunoprecipitation
5. Amplifiering av genomiska DNA
6. Gel rening av förstärkta produkter
7. Representativa resultat
Figur 1. Det övergripande målet för följande experiment är att identifiera genomiska mål KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demetylas.
(P1) Detta uppnås genom beredning av tvärbunden kromatin som är sonicated att producera DNA-fragment av lämplig storlek. (P2) Som ett andra steg är RBP2 bundna DNA-fragment immunoprecipitated med RBP2 antikroppar. (P3) Nästa är det återvunna DNA-fragment repareras i ändarna och adaptrar knyts ihop på ändarna av arvsmassans DNA för att förbereda bibliotek av arvsmassans DNA för analys på flödet celler i Illumina Cluster Station. DNA-biblioteken förökas med PCR med lågt antal cykler. (P4) Slutligen, läser belysning sekvenserat korta unikt anpassas till det mänskliga genomet, är betydande toppar identifieras och kommenterade till närmaste gener i syfte att identifiera RBP2 berikad regioner. (P5) Resultat erhålls som visar molekylära funktioner i samband med RBP2 mål gener baserat på genomet hela identifiering av RBP2 berikat regioner.
Figur 2. Kontroll av resultaten av kromatin ultraljudsbehandling vill kontrollera storleken på DNA-fragment som produceras av sonication förfarandet var 5 mikrogram (1 / 10) av det renade ingång prov lastas på 1,8% agarosgel. Som väntat producerade våra ultraljudsbehandling förfarande fragment i intervallet 150-350 bp. Men om fragmenten inte faller inom detta intervall bör sonication förfarandet anpassas därefter, genom att variera antalet brister och amplitud.
Figur 3. Gel rening av förstärkta produkter. PCR-produkter körs på en gel för att ta bort adaptrar och välj en storlek-antal mallar för klustret generations plattform. Denna gel visar att fragment i intervallet mellan 150 och 350 par bas producerades. De representerar genomiska DNA-fragment mellan 50 och 250 baspar i längd och en adapter. Vi punktskatter det markerade området gel med en skalpell. Försiktighet bör iakttas för att undvika adaptern-adaptern bandet, som uppgår till ca 120 baspar.
Figur 4. Isoform-specifik antikropp kan skilja mellan stora och små isoformer av RBP2. RBP2 protein struktur presenteras i domän vy. RBP2 innehåller flera områden: den katalytiska histon demetylering JmjC domän och tillhörande JmjN domän, en ofruktbar domän som kan sekvensspecifika DNA-bindande, en C5HC2 zink finger som potentiellt kan interagera med DNA eller andra proteiner, och flera PHD domäner. De två anti-RBP2 antikroppar som gör att skilja mellan RBP2 isoformer härrör mot RBP2 fragmenten visas med tjocka linjer.
Figur 5a. Översikt över RBP2 bindande regioner längs med kromosom och Ensembl gener. Genomisk koordinater identifierade berikad RBP2 (alla isoformer och stora isoformen) bindande regionerna presenteras kromosom klokt. Occupances av Ensembl gener (version 54, hg18) i kromosomer (kromosom 10 på bilden) presenteras som svarta fält (övre panelen). Varje RBP2 bindande regionen representeras som en vertikal linje, där den mittersta panelen visar alla RBP2 isoformer bindande regioner på kromosom 10, och den nedre panelen visar RBP2 stora isoformen bindande regioner. I mitten och botten paneler ger överblick av överlappande och specifika beläggning av RBP2 isoformer på kromosom 10.
Figur 5b. Funktionell anrikning analys av RBP2 mål gener. Heatmap visar FDR korrigeras signifikant (p-värde ≤ 0,05) berikat GO Molekylär Funktion kategorier bland de gener som är bundna (närmast gener till RBP2 bindande regionen) med RBP2 (alla och stora isoformer). Färgerna mot rött indikerar hög statistik betydelse, visar gul låga statistik betydelse, och grått ingen statistik betydelse. Anrikning analys visar överlappningen och isoformen specifika molekylära funktioner RBP2 mål gener.
Funktionella skillnader mellan RBP2 isoformer har inte fastställts. Vi har använt en övergripande strategi för att identifiera genomiska regioner bunden av RBP2 isoformer och definiera funktionella kategorier som representerar dessa regioner. Detta uppnåddes genom Chip-Seq analys följt av bioinformatik analys av erhållna sekvens läser.
RBP2 ändrar metylerade lysinrester på histon svansar. Vi fann att RBP2 stora isoformen innehåller erkännande modulen för metylerade histon lysin och RBP2 små isoformen saknar denna modul binder till olika regioner i det mänskliga genomet (Figur 5A). Viktigt isoformen-specifika regioner och överlappande regioner tillhör gener med olika molekylära funktioner (Figur 5B). Till exempel kan "kromatin bindande" och "transkriptionsfaktor bindande" funktioner tillskrivas gen mål RBP2 små isoformen men inte RBP2 stora isoform (Figur 5B). Genom att jämföra faktiska genen sätter genereras för alla isoformer och RBP2 stora isoformen (data visas inte), kan vi också definiera om stora isoformen är speciellt rekryteras till vissa gener.
Detta arbete stöddes av 115.347-RSG-08-271-01-GMC från ACS, och genom CA138631 anslag från NIH.
Oligonukleotid sekvenser 2006 Illumina, Inc. Med ensamrätt.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved