Summary
Abstract
Protocol
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Biology
Burada bir histon bağlayıcı etki alanı farklı protein izoformları genom konum analizi için bir kromatin immunoprecipitation (ChIP) prosedürü sunuyoruz. Biz KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase hedefleri belirlemek için ChIP-Seq analiz uygulayarak.
Hedeflerine transkripsiyonel ve epigenetik faktörlerin İşe Alım kendi düzenlenmesinde önemli bir adım. Göze çarpacak belirli histon modifikasyonları bağlamak protein etki işe özellikli. Böyle bir etki birkaç kromatin bağlayıcı proteinler bulunan bitki homeodomain (PHD). Epigenetik faktörü RBP2 birden fazla PHD etki vardır, ancak, farklı işlevleri vardır (Şekil 4). Özellikle, bir insan lösemi RBP2 onkojenik füzyon bulunan C-terminal PHD etki alanı, histon H3 (H3K4me3) 1 lizin 4 trimethylated bağlanır. C-terminal PHD içeren RBP2 izoformu karşılık gelen transkript 2 monositler içine promonocytic, lenfoma kaynaklı, U937 hücrelerinin farklılaşma sırasında birikir. Her iki veri setleri ile tutarlı olarak, genom analizi farklılaştırılmış U937 hücrelerinde RBP2 protein H3K4me3 3 için yüksek derecede zenginleştirilmiş genomik bölgelerde lokalize aldığını gösterdi. Için RBP2 hedeflerine Yerelleştirme H3K4me3 RBP2 histon demethylase aktivite ve transkripsiyonel aktivite azalması nedeniyle bir azalma ile ilişkilidir. Buna karşılık, RBP2 iki diğer doktoralıların H3K4me3 bağlamak mümkün değildir. Özellikle, RBP2 C-terminal etki alanı PHD küçük RBP2 izoform 4 yoktur. H3K4me3 ile etkileşim yoksun RBP2, küçük izoformu genomik yerde büyük izoformu farklıdır düşünülebilir. RBP2 izoformları genomik yerde fark RBP2 fonksiyonunda gözlenen çeşitlilik için hesap. Özellikle, RBP2 retinoblastom protein (pRB) aracılığı ile hücre farklılaşmasında önemli bir oyuncu. 2) bir RBP2 bağlı genler farklılaşma-1) RBP2 farklılaşma bağımsız bir şekilde bağlı genler: izoformları arasında ayrım gözetmeksizin bu veriler, daha önceki genom analizi ile uyumlu olarak, iki ayrı grupta RBP2 hedef genlerin tespit bağımlı bir şekilde.
Izoformları arasında yerelleştirme farkları belirlemek için ChIP-Seq genom yer analizi yapıldı. Hepimiz RBP2 hedefleri bulunan iki RBP2 izoformları tespit antikorlar kullanma. Ayrıca biz sadece büyük ve küçük RBP2 izoform (Şekil 4) bağlayan antikorlar var. Büyük izoformu hedefler belirledikten sonra, bir sonra küçük izoformu hedefleri ortaya çıkarmak için tüm RBP2 hedeflerden çıkarabilirsiniz. Bu veriler katkı genomunda bağlayıcı sitelerine protein alımında kromatin-etkileşim etki göstermektedir.
Protokol başlangıçta B. Ren, 2001 uyarlanmıştır. Odom ve arkadaşları tarafından protokol hafif bir değişiklik temsil eder. Bulunabilir 5 http://jura.wi.mit.edu/cgi-bin/young_public/navframe.cgi?s=22&f=appendices_downloads
1. Ön-blok ve manyetik boncuk antikor bağlayıcı (sonraki adım, bir gece önce uygulanmalı)
2. Hücre çapraz bağlama
3. Hücre Sonikasyon
4. Kromatin Immunoprecipitation
5. Genomik DNA amplifikasyonu
6. Amplifiye ürünlerin Jel arıtma
7. Temsilcisi Sonuçlar
Şekil 1. Aşağıdaki deneme genel amacı KDM5A/JARID1A/RBP2 histon demethylase genomik hedefler belirlemektir.
(P1) Bu, uygun büyüklükte DNA parçaları üretmek için sonicated, çapraz bağlantılı kromatin hazırlanması ile elde edilir. (P2) ikinci bir adım olarak, RBP2 bağlı DNA parçaları RBP2 antikorlar immunoprecipitated. Sonraki (P3), kurtarılan DNA parçalarının ucunda tamir ve adaptörleri Illumina Küme Station akış hücreleri genomik DNA analizi için kütüphaneler hazırlamak için genomik DNA ucu üzerine bağlandı. DNA kütüphaneler döngü az sayıda kullanarak PCR ile güçlendirilir. (P4) Son olarak, aydınlatıcı sıralı kısa benzersiz insan genomu hizalanır okur, önemli zirveleri RBP2 zenginleştirilmiş bölgeleri tanımlamak için tanımlanan ve en yakın genlere açıklamalı vardır. (P5) Sonuçlar RBP2 zenginleştirilmiş bölgelerin genom kimlik dayalı RBP2 hedef genleri ile ilişkili moleküler fonksiyonları elde edilir.
Şekil 2. Sonication prosedürü tarafından üretilen DNA parçalarının boyutlarını kontrol etmek için kromatin sonication sonuçlarını kontrol etmek, 5 mg (1 / 10), saflaştırılmış giriş numunenin% 1.8 agaroz jel üzerinde yüklenmiştir . Beklendiği gibi, bizim sonication işlem aralığı 150-350 bp parçaları üretti. Ancak, bu aralığın parçaları düşmeyin eğer sonication prosedürü patlamaları ve genlik sayısı değişen, buna göre ayarlanabilir olmalıdır.
Şekil 3. Amplifiye ürünler Jel arıtma PCR ürünleri adaptörleri kaldırmak ve küme yeni nesil platform için şablonlar bir boyut aralığı seçmek için bir jel üzerinde çalıştırılır. Bu jel, 150 ve 350 baz çifti aralığında üretilen parçaları olduğunu gösterir. 50 ve 250 baz çiftleri arasındaki uzunluk ve bir adaptör genomik DNA parçaları temsil eder. Bir neşter ile jel tüketim Seçili bölge. Bakım yaklaşık 120 baz çifti çalışır adaptörü adaptörü bant önlemek için alınmalıdır.
Şekil 4. Izoform-spesifik antikor RBP2 büyük ve küçük izoformları arasında ayırım sağlar. RBP2 protein yapısı etki alanı görünümünde sunulmaktadır . Katalitik histon demetilasyon JmjC etki alanı ve ilişkili JmjN etki, sekans spesifik DNA bağlanmasını, potansiyel DNA veya diğer proteinler ve çok sayıda PHD alanlarını ile etkileşime girebilir C5HC2 çinko parmak yeteneğine sahip bir KURAK etki alanı: RBP2 birkaç etki alanı içerir. RBP2 izoformları arasında ayırt izin iki anti-RBP2 antikorlar, kalın çizgi ile gösterilen RBP2 parçaları karşı elde edilmiştir.
Şekil 5a. Kromozom ve Ensembl genleri ile birlikte RBP2 bağlayıcı bölgelerin Genel Bakış. Genomik koordinatları (tüm izoformlarını ve büyük izoformu) bağlayıcı bölgeleri tespit zenginleştirilmiş RBP2 kromozom bilge sunulmaktadır. Ensembl genler Occupances (sürüm 54; hg18) kromozomlarda (Bu resim 10 kromozom) siyah çubuklar (üst panel) olarak sunulmuştur. Her RBP2 bağlayıcı bölgenin orta paneli tüm RBP2 izoformları kromozom 10 üzerinde bağlayıcı bölgeleri gösterir dikey bir çizgi olarak temsil ve alt panel RBP2 büyük izoformu bağlayıcı bölgeleri gösterir. Orta ve alt paneller örtüşen bakış ve kromozom 10 RBP2 izoformları belirli doluluk verir.
Şekil 5b. RBP2 hedef genlerin fonksiyonel zenginleştirme analizi. İlgi haritası FDR gösteren zenginleştirilmiş RBP2 (ve büyük tüm izoformları) (genler yakın RBP2 bağlayıcı bölgeye) bağlı genler arasında Moleküler Fonksiyon kategoriler GO (p-değeri ≤ 0.05) önemli ölçüde düzeltilmiş. Kırmızıya doğru renkler yüksek istatistik önemi gösterir, sarı düşük istatistik önemi gösterir ve gri hiçbir istatistik önemi gösterir. Zenginleştirme analizi RBP2 hedef genlerin birbiriyle örtüşen ve izoform spesifik moleküler fonksiyonları gösterir.
RBP2 izoformları arasında işlevsel farklılıklar tespit edilmemiştir. Biz RBP2 izoformları bağlı genomik bölgelerin belirlenmesi ve bu bölgelerde temsil ettiği fonksiyonel kategoride tanımlamak için kapsamlı bir yaklaşım kullandık. Bu elde edilen dizisi biyoinformatik analiz okur takip ChIP Seq analizi ile gerçekleştirildi.
RBP2 histon kuyrukları metil lizin kalıntılarının değiştirir. Biz RBP2 büyük izoformu, insan genomu (Şekil 5A) farklı bölgelerinde bu modül bağlama eksik metil histon lisin ve RBP2 küçük izoformu için tanıma modülü içeren bulundu. Önemlisi, izoform belirli bölgelerde ve örtüşen bölgelerinde farklı moleküler fonksiyonları (Şekil 5B) ile genler aittir. Örneğin, "kromatin bağlayıcı" ve "transkripsiyon faktörü bağlayıcı" fonksiyonları RBP2 küçük izoformu gen hedefleri atfedilen olabilir ama değil RBP2 büyük izoformu (Şekil 5B). Gerçek gen karşılaştırarak büyük izoformu özellikle bazı genlerin işe ise tüm izoformları ve RBP2 büyük izoformu (veriler gösterilmemiştir) için, biz de tanımlayabilirsiniz oluşturulan ayarlar.
Bu çalışma NIH den 115.347-RSG-08-271-01-GMC ACS ve CA138631 tarafından hibe tarafından desteklenmiştir.
Oligonükleotid dizileri 2006 Illumina, Inc Tüm hakları saklıdır.
ABOUT JoVE
Copyright © 2024 MyJoVE Corporation. All rights reserved