C. elegans Positive Butanone Learning, kurzfristige und langfristige Assoziative Speicher Assays

Summary

Hier beschreiben wir Methoden zu testen, C. elegans assoziativen Lernens sowie kurz-und langfristigen assoziativen Gedächtnisses. Diese Bevölkerung Assays verwenden die Würmer Fähigkeiten chemotax Richtung flüchtigen Geruchsstoffe und bilden positive Assoziationen bei Paarung Essen mit dem Lockstoff Butanon. Erhöhung der Zahl der Konditionierung Perioden induziert Langzeitgedächtnis.

Abstract

Die Erinnerung an Erfahrungen und gelernten Informationen ist entscheidend für die Organismen an Entscheidungen, die ihr Überleben Hilfe zu machen. C. elegans navigiert ihre Umwelt durch Neuronen-spezifischen Nachweis von Nahrungsmittel-und chemische Gerüche ^{1, 2,} und kann nutritive Staaten mit chemischen Gerüche ^3, Temperatur ⁴ und die Pathogenität eines Lebensmittels Quelle ⁵ zu verbinden.

Hier beschreiben wir Untersuchungen von C. elegans assoziativen Lernens sowie kurz-und langfristigen assoziativen Gedächtnisses. Wir modifizierten einen aversiven olfaktorischen Lernparadigma ⁶ bis produzieren stattdessen eine positive Antwort; der Test beinhaltet hungernden ~ 400 Würmer, dann füttern die Würmer in der Gegenwart des AWC Neuron-spürte flüchtigen Lockstoff Butanon bei einer Konzentration, die eine geringe chemotaktische Index hervorruft (ähnlich zu Toroyama et al. ^7). Ein Standard-Bevölkerung Chemotaxis assay1 testet die Würmer "Anziehungskraft auf die Geruchsrezeptoren sofort oder Minuten bis Stunden nach der Konditionierung.

Nach der Konditionierung Wildtyp-Tieren "Chemotaxis zu Butanon erhöht ~ 0,6 Chemotaxis Index-Einheiten, die" Learning Index ". Assoziativen Lernens ist abhängig von der Anwesenheit von Nahrung und Butanon während des Trainings. Pairing Essen und Butanon für eine einzelne Dauer der Konditionierung ("massiert training") produziert kurzfristige assoziative Speicher, ~ 2 Stunden dauert. Mehrere Klimaanlage Perioden mit Ruhezeiten zwischen ("Abstand training") liefert langfristige assoziativen Gedächtnisses (<40 Stunden) und ist abhängig von der cAMP Response Element Binding Protein (CREB), ⁶ ein Transkriptionsfaktor für das Langzeitgedächtnis über erforderliche Spezies. ⁸

Unser Protokoll enthält auch Methoden der Bildanalyse für die schnelle und genaue Bestimmung der Chemotaxis-Indizes. Kontrastreiche Bilder von Tieren auf Chemotaxis Assay-Platten werden erfasst und durch Zählen Wurm Software in MatLab analysiert. Die Software korrigiert für unebene Hintergrund mit einer morphologischen tophat Transformation. ⁹ Otsu-Verfahren wird dann verwendet, um einen Schwellenwert zu trennen Würmer aus dem Hintergrund bestimmen. ¹⁰ Sehr kleine Partikel werden automatisch entfernt größere nicht-Wurm Regionen (Blechkanten oder Agar Schläge) sind entfernt durch manuelle Auswahl. Die Software schätzt dann die Größe der einzelnen Wurm durch das Ignorieren Regionen, die über einem bestimmten maximalen Größe sind und unter die mittlere Größe der übrigen Regionen. Die Zahl der Würmer wird dann durch Division der gesamten Fläche als belegt durch Würmer identifiziert durch die geschätzte Größe eines einzelnen Wurms geschätzt.

Wir haben festgestellt, dass das Lernen und die kurz-und Langzeitgedächtnis unterschieden werden können, und dass diese Prozesse ähnlich wichtige Moleküle teilen mit höheren Organismen. ^6,8 Unsere Tests können schnell zu testen neue Kandidatengene oder Moleküle, die Lern-und kurz-oder langfristig beeinflussen Kurzzeitgedächtnis in C. elegans, die relevant über Arten sind.

Protocol

Diese C. elegans assoziatives Lernen und Gedächtnis-Tests erfordern Vorbereitung. Für einen empfohlenen Zeitplan der Vorbereitung finden Sie in der Zeitleiste in Abbildung 1A dargestellt. Beachten Sie auch, dass Würmer "Erinnerungen durch physische Bewegung (rough Pipettieren, Zentrifugieren, Vortex) gestört werden kann, und dass naive Chemotaxis kann durch übermäßige Gerüche (Parfüm, etc.) in die Umwelt gestört werden.

1. Vorbereitung der Tiere auf Assay

1. Pflegen Würmer auf 100 mm hohen Wachstumsraten Medien (HGM) Platten (siehe Abschnitt 7.1 für Rezept) ausgesät mit 1 mL OP50 E. coli unter Verwendung von Standardverfahren. ¹¹
2. Hypochlorit-Behandlung mindestens zwei dicht besiedelten HGM Platten gravid erwachsenen Würmer zu einem großen synchronisiert Bevölkerung von Eiern zu erhalten.
   Hinweis: Für die besten Ausbeuten, bleichen die erste Generation, die eine hoch synchronisiert Bevölkerung zu erhalten, dann bleichen die zweite Generation als Tag 2 Erwachsene, um Eier für den nachfolgenden Schritt zu erhalten.
3. Gleichmäßig teilen Eier auf 3-4 HGM-Platten mit 1 mL OP50 E. ausgesät coli für jeden Hypochlorit behandelte Platte.
   Hinweis: Es ist wichtig, dass die Würmer mit viel frischer Lebensmittel angebaut werden, wie Hunger das Ergebnis der olfaktorischen Tests beeinflussen können.
4. Inkubieren Würmer bei 20 ° C für ca. 72 Stunden, die Zeit, die für Tiere erreichen die jungen erwachsenen Stadium.

2. Pre-Konditionierung Starve

1. Überprüfen Sie Ihre HGM-Platten mit jungen Erwachsenen um sicherzustellen, dass die Würmer immer noch reichlich zu essen, und dass es genügend Würmer für den Test (≥ 200 Würmer pro Testplatte).
2. Wash Würmer aus der HGM-Platten mit M9-Puffer ¹¹ in eine 15 ml konischen Rohr. Für die am wenigsten Aufregung während wäscht, sanft die M9-Puffer durch Gießen ein paar Milliliter auf die HGM Platte, und schwenken Sie die Platte frei Würmer aus dem klebrigen OP50 Bakterien. Next, neigen Sie die Platte, ziehen Sie die M9-Puffer / Wurm Gemisch aus der Ecke der Platte mit einem P1000 Pipetman, und übertragen Sie die Würmer, die 15 ml konischen Rohr. Wenn Würmer noch auf dem Teller übrig sind, wiederholen Sie diesen Schritt 1-2X.
   Hinweis: Rough Waschen verdrängt Bakterien aus der Platte, dass sie in das Rohr kann mit den Würmern. Diese Bakterien unmöglich ist, um loszuwerden, und kann mit den Assays stören. NICHT Pipette Würmer gegen die Seite des Rohres, da dies die Würmer schädigen kann und beeinträchtigen die Assays.
3. Lassen Würmer durch die Schwerkraft absetzen (nicht zentrifugieren). Überstand entfernen durch Vakuum und wäscht mit mindestens 3-4 ml M9. Wiederholen Sie 2X für insgesamt 3 Wäschen.
   Hinweis: Zentrifugieren während wäscht ziehen wird, um alle verbleibenden Bakterien in die Wurm Bevölkerung, die mit den Assays stören können. Stattdessen sanft hinzu M9-Puffer für die nachfolgende Wäschen durch Gießen direkt in den 15 mL konischen Rohr. Worms am unteren Rand des Rohres nieder sollten in der M9-Puffer vermischt werden nach ihrer Zugabe. Wenn Würmer blieben nieder, sanft das Röhrchen zu mischen.
4. Nach dem dritten Waschen, verwenden einige der Wurm Bevölkerung für naiv Chemotaxis-Assays (Abschnitt 5).
   Hinweis: Es ist wichtig, relativ schnell Arbeit auf allen Wasch-Schritten, wie Würmer beginnen zu verhungern, wenn sie zu lange in M9-Puffer, der die naive Chemotaxis in Richtung Butanon erhöhen sitzen kann.
5. Fügen Sie 3-4 ml M9-Puffer auf die 15 mL konischen Rohr, lassen Würmer in M9-Puffer verhungern bei Raumtemperatur für 1 Stunde (Abbildung 1B, C).

3. Kurzfristige Assoziative Speicher (massiert) Training

Siehe Abbildung 1B für kurzfristige assoziative Speicher-Test-Workflow.

1. Am Ende des verhungern Zeitraum in M9-Puffer (Abschnitt 2), Ader 2 ul von 10% Butanon (in 95% EtOH) auf der Innenseite der Deckel von 60 mm Nematoden Nährmedien (NGM) ¹¹ Platten, die mit wurden ausgesät 500 ul OP50 E. coli.
   Hinweis: Ein guter Ausgangspunkt Bevölkerung für Kurz-und Langzeitgedächtnis-Assays ist ≥ 500 ul von Würmern. Mehrere Klimaanlage Platten pro Genotyp benötigt, um die gesamte Bevölkerung während des Trainings zu unterstützen. Bei der Arbeit mit flüchtigen Chemikalien, nur offene Deckel der Platten bei Bedarf, so dass sie geschlossen zu allen anderen Zeiten.
2. Nehmen Sie die M9-Puffer Überstand aus der 15 ml konischen Rohr von verhungerten Würmer durch Vakuum und mit einem P1000 Pipetman auf 100-200 ul von Würmern, die Konditionierung Platten gelten.
   Hinweis: Versuchen Sie, so viel M9 Flüssigkeit wie möglich zu entfernen, so dass Würmer können schnell auf die OP50 Nahrungsquelle zu erhalten, wenn die Klimaanlage Platten übertragen. Worms wird an der Innenseite der Pipettenspitze haften und kann durch Pipettieren kleiner Volumina konserviert werden.
3. Inkubieren Klimaanlage Platten bei Raumtemperatur für 1 Stunde (Abbildung 1B).
4. Wash Würmer aus der Platten mit ca. 1 mL M9-Puffer in ein 15 mL konischen Rohr. Lassen Würmer durch die Schwerkraft zu begleichen. Dann wird noch einmal 1-2X bis M9-Puffer in die Röhre, ist klar.
   Hinweis: Verwenden Sie den sanften Waschverfahren in Abschnitt2. Die gleichen 15 mL konischen Rohr kann von Abschnitt 2 verwendet werden.
5. Nach dem letzten Waschen, entfernen Sie die M9-Puffer Überstand mittels Vakuum, und verwenden Sie einige der Wurm Bevölkerung für die Chemotaxis-Assays (Abschnitt 5) für 1x-Test (massiert) assoziativen Lernens der Lebensmittel-Butanon Verein unmittelbar nach der Konditionierung (0 Minuten-Zeitpunkt ).
   Learning Index (LI) = CI _{0 Std.} - CI _Naive.
6. Übertragung der restlichen Bevölkerung von Würmern bis 60 mm NGM-Platten mit 500 ul OP50 (hold-Platten) ausgesät. Auch hier gelten 100-200 ul der Würmer pro Platte, um sicherzustellen, gibt es genug Bakterien, um die Bevölkerung zu unterstützen.
   Hinweis: Die Anzahl der Platten pro Genotyp halten wird mindestens die Anzahl der kurzfristigen assoziativen Gedächtnisses Zeitpunkten getestet werden.
7. Inkubieren post-Konditionierung Platten für 0,5, 1 oder 2 Stunden (kurzfristige assoziativen Gedächtnisses Zeitpunkten) bei Raumtemperatur (Abbildung 1B).
   Hinweis: Kurzfristige assoziativen Gedächtnisses von Wildtyp-Tieren endet um 2 Uhr nach dem Training. Zeitpunkten Möglicherweise müssen Sie für verschiedene Genotypen oder angepasst werden.
8. Um zu testen, für kurzfristige assoziative Erinnerung an die Lebensmittel-Butanon Verein, nach jedem Zeitpunkt, vorsichtig waschen Würmer aus Platten in eine 15 ml konischen Rohr und wieder 1-2X mit M9-Puffer. Verwenden Würmer für die Chemotaxis-Assays (Abschnitt 5). Learning Index (LI) = CI _Zeitpunkt - CI _Naive.
   Hinweis: Verwenden Sie den sanften Waschverfahren in Abschnitt 2 beschrieben. Für jeden Zeitpunkt, zu verwerfen zusätzliche Würmer, die nicht in Chemotaxis-Assays verwendet werden.

4. Langfristige Assoziative Speicher (Spaced) Training

Siehe Abbildung 1C für den langfristigen assoziativen Speicher-Test-Workflow.

1. Folgen Sie den Schritten von 3,1 bis 3,2 in Abschnitt 3.
2. Inkubieren Klimaanlage Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten (Abbildung 1C).
3. Folgen Sie Schritt 3.4 in Abschnitt 3.
   Hinweis: Um weiterhin in einem 30-Minuten-Frist, kann man alle wäscht während des Trainings bei ~ 25 Minuten beginnen.
4. Nach dem letzten Waschen entfernen M9 Überstand mittels Vakuum und Transfer Würmer ungesetzte 60 mm NGM-Platten.
   Hinweis: Die Verwendung mehrerer Platten pro Genotyp ist nicht bei diesem Schritt erforderlich, da die Würmer sind ausgehungert werden.
5. Hungern auf 60 mm NGM Platten bei Raumtemperatur für 30 Minuten (Abbildung 1C).
6. Wash Würmer mit M9-Puffer in die 15 ml konischen Rohr. Lassen Würmer durch die Schwerkraft absetzen (nicht zentrifugieren).
   Hinweis: Zwar gibt es keine Bakterien werden sollte in dem Puffer an dieser Stelle, Zentrifugieren kann eine potenziell schädliche Behandlung der Würmer werden und können langfristig Gedächtnisbildung zu stören.
7. Wiederholen Sie die Schritte 4,1-4,6 mehrmals, bis eine Gesamtmenge von 7 Konditionierung Blöcke und 6 verhungern Blöcke abgeschlossen (Abbildung 1C). (Siehe Tabelle 1 für einen repräsentativen Zeitraum Blatt.)
8. Vorsichtig waschen Würmer aus Platten in die 15 ml konischen Rohr und wieder 1-2X mit M9-Puffer.
9. Nach dem letzten Waschen, verwenden einige der Wurm Bevölkerung für die Chemotaxis-Assays (Abschnitt 5) für 7x Test (Abstand) assoziativen Lernens der Lebensmittel-Butanon Verein unmittelbar nach der Konditionierung (0 Stunden-Zeitpunkt). Learning Index (LI) = CI _{0 Std.} - CI _Naive.
10. Übertragung der restlichen Bevölkerung von Würmern zu 100 mm HGM-Platten mit 1 ml OP50 (hold-Platten) ausgesät. Auch hier gelten 100-200 ul der Würmer pro Platte, um sicherzustellen, gibt es genug Bakterien, um die Bevölkerung zu unterstützen.
    Hinweis: Die Anzahl der Platten pro Genotyp halten wird mindestens die Anzahl der langfristigen assoziativen Gedächtnisses Zeitpunkten getestet werden. 100 mm NGM-Platten können auch als post-Konditionierung Platten verwendet werden, aber man muss sehr vorsichtig sein, dass es genug OP50, um die Bevölkerung von Würmern für mindestens 16 Stunden zu unterstützen.
11. Inkubieren post-Konditionierung Platten für 16, 24 und 40 Stunden (Langzeit-assoziativen Gedächtnisses Zeit Punkte) bei 20 ° C (Abbildung 1C).
    Hinweis: Langfristige assoziativen Gedächtnisses von Wildtyp-Tieren endet um 40 Uhr nach dem Training. Zeitpunkten Möglicherweise müssen Sie für verschiedene Genotypen oder angepasst werden.
12. Um zu testen, für die langfristige assoziative Erinnerung an die Lebensmittel-Butanon Verein, vorsichtig waschen Würmer aus Platten in eine 15 ml konischen Rohr und wieder 1-2X mit M9-Puffer nach jedem Punkt. Verwenden Würmer für die Chemotaxis-Assays (Abschnitt 5). Learning Index (LI) = CI _Zeitpunkt - CI _Naive.
    Hinweis: Verwenden Sie den sanften Waschverfahren in Abschnitt 2 beschrieben. Für jeden Zeitpunkt, zu verwerfen zusätzliche Würmer nicht in der Chemotaxis-Assays verwendet.

5. Chemotaxis Assay

1. Bereiten Sie die Chemotaxis Assay-Platten. Markieren Sie die Unterseite des ungesetzte 100 mm NGM-Platten mit Flecken auf dem Boden und auf jeder Seite der Platte (Abbildung 2A).
   Hinweis: Mindestens 3 Wiederholungen pro Genotyp laufen müssen, um statistisch signifikante Ergebnisse zu erzielen.
2. Spot 1 ul 1 M NaN ₃ im Riech-undKontrolle vor Ort (Abbildung 2B).
   Hinweis: Nicht vor Ort Ihre Platten mit dieser lähmenden Agent mehr als 15 Minuten vor Beginn des Tests oder die NaN ₃ wird entfernt diffundieren aus dem Flecken, und Tiere werden gelähmt vor dem Erreichen des Geruchs oder Kontrolle Flecken. Achten Sie darauf, Punktion der Agar bei der Anwendung NaN _3, da Würmer wühlen in punktierten Bereiche.
3. Während die Würmer sind in der konischen Rohr Abrechnung nach mehreren M9-Puffer gewaschen (Abschnitt 2), Spot 1 ul jeweils 95% EtOH und 10% Butanon (siehe Abschnitt 7.2) bei den entsprechenden Stellen auf den markierten Testplatte (Abbildung 2C) auf Spitze des zuvor gesichtet NaN 3.
   Hinweis: Chemikalien müssen vor gesichtet werden, um das Hinzufügen der Würmer (Abschnitt 5.4). Notieren Sie sich die Spot hat EtOH oder Butanon. Beim Arbeiten mit diesen flüchtigen Chemikalien, achten Sie darauf, nur öffnen Sie den Deckel der Platten, wenn nötig, und halten sie geschlossen zu allen anderen Zeiten.
4. Entfernen Sie so viel von der M9-Puffer wie möglich aus dem Rohr nieder Würmer. Verwenden Sie ein P20 Pipetman mit einem Pre-Cut-Spitze (siehe Abschnitt 7.3) bis 3x 5 ul Würmer (200-400 Tiere), um die Herkunft der gekennzeichneten Testplatte (Abbildung 2D) zu liefern.
   Hinweis: Bewahren übrigen Würmer in der 15 ml konischen Rohr für den Einsatz in Pre-Konditionierung Hungern und Gedächtnis-Tests (§ § 2-4). Worms wird in Pipettenspitzen-Stick, so das Hinzufügen Würmer, die Platte in kleineren Mengen schont Ihren Wurm Bevölkerung und reduziert die Menge der Flüssigkeit, die mit den Würmern auf die Assay-Platte veröffentlicht wird.
5. Twist der Ecke eines Kimwipe zu einem kleinen Punkt und es verwenden, um blot das überschüssige M9-Puffer. Hierdurch wird die Würmer auf die Testplatte (Abb. 2E).
   Hinweis: Achten Sie darauf, Punktion der Agar mit dem Kimwipe, sonst Würmer graben am Ursprung wird. Manche Würmer können in diesem Schritt verloren werden, da sie in den Kimwipe mit der M9-Puffer gezogen werden, wenn Löschpapier. Bei Verwendung von Abbildung und Analyse von Würmern (§ 6) zu zählen, nehmen Platten auf Imaging-Station vor dem Loslassen Würmer aus dem Ursprung. Ein Bild von den Würmern am Ursprung unmittelbar nach der Freigabe wird die Gesamtzahl der Tiere für eine Testplatte geben.
6. Inkubieren Sie die Chemotaxis Assay-Platte für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
7. Zählen Sie die Anzahl der Würmer im Ursprungsland, EtOH, und Butanon-Spots (Abbildung 2), sowie die Gesamtzahl der Würmer auf die Testplatte.
   Hinweis: Im Allgemeinen, Würmer von NaN ₃ gelähmt wird innerhalb ~ 1 cm Radius der Punkte sein, und erscheint stick-Geraden mit vielen Tieren gegeneinander gestapelt. Bei Verwendung von Imaging-und Analyse-Software, um Würmer (§ 6) zu zählen, nehmen Bilder von der Entstehung, EtOH, und Butanon Flecken. Ein Bild des Gesamtbetrages von Würmern sollten in Abschnitt 5.5 aufgenommen worden sein. Worms kann auch sein "Hand-gezählt."
8. Berechnen Sie die "Chemotaxis Index" (CI). CI = ([(n _Butanon) - (n _EtOH )]/[( Total-n _Origin)].

6. Worm Zählen von Image Analysis

1. Nehmen Sie kontrastreiche Schwarz-Weiß-Bilder von Würmern auf Chemotaxis Assay-Platten (Abbildung 3A, siehe Abschnitt 7.4 für die Beschreibung der Kamera-Setup). Zur Berechnung eines Chemotaxis-Index, werden die Bilder auf der Butanon, EtOH benötigt, und die Herkunft Spots einer Chemotaxis Assay-Platte am Ende eines Tests, sowie die Gesamtzahl der Würmer (Bild von Würmern im Ursprungsland sofort, nachdem sie aus freigegeben werden M9-Puffer zu Beginn des Tests, Abschnitt 5.5).
   Hinweis: Bilder der Chemotaxis Assay-Platten für ca. 2 cm Radius um jeden Ort in der Regel erfassen alle Tiere für jeden Fleck.
2. Stellen Sie sicher, die Dateien für alle Versuche mit einem Zeitpunkt (zB Naive, 0 Std., etc.) in einem Ordner enthalten sind, benannt angemessen.
3. Dateien für jeden Chemotaxis Platte muss als solche benannt werden: aber # png (Butanon Ort, Versuch #), ori # png (Herkunft, Versuch #), eth # png (Ethanol Ort, Versuch #), tot # png.... (insgesamt, Versuch #). (Zum Beispiel, wenn zwei Versuche für einen Zeitpunkt ausgeführt wurden, in den gleichen Ordner die folgenden Dateien vorhanden wäre: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . png, tot2.png)
4. Öffnen Sie Matlab (siehe Abschnitt 7.5).
5. In der "Current Directory" Zeile am oberen Rand des Matlab-Fenster, für die Ordner zu durchsuchen, und wählen Sie die "count_worms_v0.5.3"-Ordner (M-Dateien als ergänzende Information).
6. In der "Command Window", Typ "count_worms_directory ()." Drücken Sie die Eingabetaste.
   Hinweis: Die Standard-Wurm Größe, wenn für diesen Befehl ist min 10, max 80 Pixel. So passen Sie diese an einem bestimmten Genotyp oder Entwicklungsstadium, Typ "count_worms_directory ('minsize', 10 'maxsize', 80)" und ändern Sie die Pixel-Zahlen entsprechend auf.
7. Wenn Sie aufgefordert werden, wählen Sie den Ordner mit Bildern analysiert werden.
   Hinweis: Nur ein Ordner mit Bildern auf einmal analysiert werden.
8. Jedes Bild in den Ordner, die analysiert werden Pop-up mit einer Schwelle bereits eingestellt, und Partikel ausgewählt (Abbildung 3A). Ziehen Sie das Rechteck-Werkzeug über ausgewählte Partikel, die nicht Würmer th löschenem. Wenn mit dem Bild fertig sind, drücken Sie die Esc-Taste.
9. Nachdem alle Bilder im Ordner markiert sind, werden 4 Spalten in das Befehlsfenster angezeigt: (1) Bild-Namen (zB but1), (2) immer "[1];" (3) durchschnittlich Pixelgröße für einen Wurm durch die berechneten Programm das jeweilige Bild, und (4) die Zahl der Würmer berechnet, um das Bild zu kommen.
10. Sobald dieses Programm ausführen, wird es Hinterlegung zwei. Csv-Dateien (kann als Excel-Tabellen geöffnet werden) in den Ordner der Bilder ist nur analysiert hat. Die "worm_counts_stats"-Datei enthält die Ausgabe Spalten in der Command Window (§ 6,9) gefunden. Die "worm_counts_summary" Datei enthält 5 Spalten: (1) Studie Nummer, Anzahl der Würmer in (2), aber (3) eth, und (4) ori-Spots, und (5) Gesamtzahl der Würmer.

7. Materialien Hinweise

1. Um 100 mm hohen Wachstumsraten Medien (HGM) Platten (Abschnitt 1) ​​vorzubereiten: Lösen Sie 3 g NaCl, 20 g Bactopepton, und 30 g Bacto-Agar in 700 ml destilliertem Wasser. Bringt Volumen auf 1 l mit destilliertem Wasser. Nach dem Autoklavieren, kühlen Agar 65 ° C und 4 ml 5 mg / ml Cholesterin in Ethanol, 1 mL 1 M CaCl _2, 1 M MgSO _4, und 25 ml 1 M KPO ₄ (pH = 6,0).
2. 95% EtOH verwendet wird, wie höheren Prozentsatz EtOH neigt dazu, Verunreinigungen aus dem Reinigungsprozess, dass die Ergebnisse beeinflussen können, enthalten. Es ist eine gute Idee, die 10%-Butanon (in 95% EtOH) tanken frische alle paar mal ist der Test zum Laufen zu bringen.
3. P20 Tipps müssen ein paar Millimeter abgeschnitten, ein Loch groß genug für Würmer Passform durch, ohne Schaden zu erstellen. P1000 Tipps haben schon Löcher groß genug für die Würmer durch passen.
4. Die Chemotaxis Assay-Platte Imaging-Station (3B) in der Murphy-Labor enthält einen Firewire-Kamera mit variabler Vergrößerung Objektiv zu einem Boom stehen. Eine Hintergrundbeleuchtung ist an der Unterseite des Ständers unter eine benutzerdefinierte Imaging-Plattform mit einer Glasplatte (Abbildung 3C), die Chemotaxis Assay-Platten von unten beleuchtet werden können platziert. "Measurement and Automation"-Software (National Instruments) wird verwendet, um Bilder zu fassen. Materialien für diese Imaging-Station eingerichtet sind ähnlich wie zuvor veröffentlichten, ¹² und kann in der Tabelle der spezifischen Reagenzien und Geräte gefunden werden.

8. Repräsentative Ergebnisse:

Eine typische naive Chemotaxis-Index (CI) für Wildtyp-Würmer für 10% Butanon beträgt rund 0,2 (Abbildung 4A). ⁶ Massed (1x) oder Abstand (7x) Ausbildung erhöht im Allgemeinen die Chemotaxis Index 0,7-0,8 zum Zeitpunkt 0 (Abbildung 4A, CD) zu einem Lern-Index (LI = geschult CI -. naive CI) von ~ 0.6 ⁶ Das Lernen, das mit massiert oder verteilt Training auftritt, ist sehr robust. Ein LI von weniger als 0,5 in der Regel entsteht, wenn es Probleme mit der naiven Chemotaxis-Assay, und die Tiere haben einen naiven CI von 0,3 oder höher. Normalerweise geschieht dies, weil Würmer verhungern oder zu sehr auf den Anbau Platten zwischen Bleich-und dem Beginn des Tests oder Würmern überfüllt sitzen zu lange in M9 Puffer zwischen wäscht und beginnen zu hungern; Umwelt Gerüche können auch die naive CI. Starved Würmer haben eine viel höhere naiv CI 10% Butanon (Abbildung 4B). ⁶ Wir finden, dass die Probleme mit dem naiven Chemotaxis in der Regel mit verbesserter Wurm Pflege und Kultivierung aufgelöst.

Die Dauer des Gedächtnisses in diesen Assays ist die Zeit, die für die Chemotaxis Index direkt nach dem Training zu naiv Niveau zurückkehrt, wenn die Lern-index = 0. In Wildtyp-Tieren, kurzfristige assoziativen Gedächtnisses beginnt typischerweise um 1 Stunde nach massierten Ausbildung sinken, dauert ca. 2 Stunden und ist unabhängig von der Transkriptionsfaktor CREB (4C). ^{6 Langfristige} assoziativen Gedächtnisses in der Regel nicht beginnen deutlich zurückgehen, bis 16 Stunden nach Abstand Ausbildung dauert bis zu 40 Stunden und ist CREB-abhängige (Abbildung 4D) ^{6 Langfristige} assoziative Speicher kann nicht sein volles Potenzial erreichen in mehreren Fällen: (1). Würmer haben nicht genug OP50 E. coli in 30-minütigen Konditionierung Perioden, (2) Bakterien bleiben in der M9-Puffer während Hungerperioden, oder (3) Würmer sind während des Tests (z. B. Würmer sind gegen die Seite des pipettiert) beschädigt.

Ergebnisse sind in der Regel statistisch signifikant, wenn 4 oder mehr Chemotaxis Assay Versuche pro Genotyp pro Zeitpunkt ausgeführt werden. Laufen sechs Wiederholungen pro Genotyp in der Regel liefert sehr signifikante Ergebnisse, ohne dabei zu viel zu handhaben, aber Anfänger könnten sich mit nur drei Wiederholungen beginnen. Generell arbeiten mit 2-3 Genotypen oder Bedingungen zu einer Zeit, ist bequem für diejenigen, die mit diesen Lern-und Gedächtnisleistung Assays erlebt werden.

Hand-Zählung Würmer auf Chemotaxis Assay-Platten ist sehr zeitaufwendig, kann add Variabilität zwischen Experimenten im Labor oder Kollegen, und kann auch vorstellen Verzerrungen bei der Analyse und interpreting Daten. Worm Zählen durch Bildanalyse (§ 6) standardisiert Datenerfassung und-analyse über das Labor und im Durchschnitt schneidet Datenanalyse Zeit für erfahrene lab Mitglieder 1 / 5 der für die Hand zu zählen brauchte. Beim Vergleich Chemotaxis-Indizes berechnet mittels manueller Wurm zählt zu den vom Count_worms Software bestimmt, finden wir einen durchschnittlichen Fehler von 3,07 (± 1,19)%.

Tag 1
Zeit	Schritt
09.00	1 Stunde in M9-Puffer verhungern Starten naiv Chemotaxis Assay
10.00	Zustand # 1 (60 mm NGM-Platten mit Speisen und Butanon), 30 min End naiv Chemotaxis Assay
10.30	Hungern # 1 (60 mm NGM-Platten), 30 min
11.00	Bedingung 2, 30 min
11.30	Hungern Nr. 2, 30 min
12.00	Zustand Nr. 3, 30 min
00.30	Hungern Nr. 3, 30 min
01.00	Zustand Nr. 4, 30 min
01.30	Hungern Nr. 4, 30 min
02.00	Zustand Nr. 5, 30 min
02.30	Hungern Nr. 5, 30 min
03.00	Zustand Nr. 6, 30 min
03.30	Hungern Nr. 6, 30 min
04.00	Zustand Nr. 7, 30 min
04.30	Begin 0-hr Chemotaxis Assay Restlichen Würmer Platten für 16-40 Stunden halten
05.30	End 0-hr Chemotaxis Assay
Tag 2
Zeit	Schritt
08.30	Begin 16-Stunden-Chemotaxis-Assay
09.30	End 16-Stunden-Chemotaxis-Assay

Tabelle 1. Representative Zeitplan für langfristige assoziative Gedächtnis-Test. In diesem Beispiel beginnt der Test an Tag 1 um 9 Uhr mit einer 1-stündigen verhungern. 30-min Zustand und verhungern Perioden abgewechselt, bis die Würmer wurden sieben Mal gewährt haben. Chemotaxis-Assays sind am Anfang (naive) und Ende (0 h) der Trainingslauf. Die gesamte Laufzeit von Anfang bis Ende ist 8,5 Stunden. Worms gehalten Platten sind für die Chemotaxis zu Butanon beginnend am Tag 2, 16-40 Stunden nach dem Training getestet.

Abbildung 1. Kurzfristige und langfristige assoziative Speicher-Test-Workflow. (A) Empfohlene Zeitleiste der Vorbereitung bis zum Tag Assays durchgeführt werden. (B) Kurzfristige assoziative Gedächtnis-Test: Starved Würmer sind für 1 Stunde konditioniert und sofort getestet für 1x Lernen (0 min.) Via Chemotaxis-Assays oder übertragen auf Halteplatten mit Lebensmitteln für 0,5, 1 oder 2 Stunden nach der Konditionierung. (C) Langfristige assoziative Gedächtnis-Test: Starved Tiere erhalten 7 Trainings-Blöcke Klimaanlage / verhungern, bevor sie zum Lernen oder LTAM 16-40 Stunden nach dem Training getestet.

Abbildung 2. Chemotaxis-Assay-Setup. (A) Schematische Darstellung der Chemotaxis Assay-Platte. Kleine Flecken auf der Platte mit Hilfe eines Herrschers oder anderen Leiteinrichtung auf die Herkunft (unten) und Butanon und EtOH (links und rechts) Flecken auf der Platte Marke hinzugefügt. (B) 1 ul NaN ₃ ist mit dem Butanon und EtOH Spots aufgenommen. (C) 1 ul jeweils 10% Butanon und 95% EtOH sind die Flecken auf der linken oder rechten Seite der Platte aufgenommen. (D) 200-400 Würmer in M9-Puffer suspendiert sind, um die Herkunft der Platte gegeben. (E) A Kimwipe in einen Punkt gedreht wird verwendet, um M9-Puffer und Freigabe Würmer auf der Testplatte zu absorbieren.

Abbildung 3. Worm Zählen mit Bildanalyse. (A) Beispiel für "count_worms_v0.5.3" image Partikel Auswahlfenster. Das Programm öffnet original kontrastreiche Schwarz-Weiß-Bild (links) automatisch öffnet sich ein Fenster mit einem Schwellenwert Bild (Mitte). Das Rechteck-Werkzeug kann verwendet werden, um zu markieren, und beseitigen unerwünschte nicht-Wurm "Teilchen", wie Assay-Platte markiert (1), Blechkanten (2), oder Agar Einstiche (3) sein. (B) Bild des Murphy-Labor Chemotaxis Assay Bildbearbeitungs-Station. Chemotaxis Assay-Platten werden von unten beleuchtet, um Bilder mit hohem Kontrast für die Analyse erforderliche erstellen. (C) Schematische Darstellung der maßgeschneidertenImaging-Plattform in der Chemotaxis Imaging-Station verwendet.

Abbildung 4. Typische assoziativen Lernens und des Gedächtnisses führt. (A) Die naive Chemotaxis Index der Wildtyp-Würmer zu 10% Butanon steigt auf massierten (1x) Ausbildung. Der gelernte Assoziation ist, erfordert die Kopplung von Nahrungsmitteln (OP50 E. coli) und Butanon. Zahlen über Balken stellen die "Learning Index" (LI = CITrained - CI _Naive). (B) Wildtyp naiven Chemotaxis zu 10% Butanon ist stark erhöht, wenn Würmer für 16 Stunden sind verhungert. Panels AD sind von Kauffman et al angepasst., 2010. ⁶ (C) Wildtyp kurzfristige assoziativen Gedächtnisses dauert ca. 2 Stunden und ist unabhängig von der Transkriptionsfaktor CREB. (D) Wild-Typ langfristigen assoziativen Gedächtnisses dauert etwa 40 Stunden, und ist CREB-abhängig.

Ergänzende Informationen

• Klicken Sie hier für die "imoverlay.m"-Datei .
• Klicken Sie hier für die "count_worms_image.m"-Datei .
• Klicken Sie hier für die "count_worms_directory.m"-Datei .
• Klicken Sie hier für die "cellwrite.m"-Datei .

Discussion

Die C. elegans olfaktorischen assoziativen Lernens und des Gedächtnisses Assays hier vorgestellten unterscheiden zwischen den Prozessen der massierten Lernen, voneinander Lernen, Kurzzeitgedächtnis und Langzeitgedächtnis. Diese Assays basieren auf der Würmer 'Fähigkeiten, Lebensmittel-und chemischen Gerüche in ihrer Umgebung ^1,2 Gefühl und positive Assoziationen zwischen den beiden zu bilden. ⁶ Darum sind die Tests sehr empfindlich auf Hunger in der Startelf Population von Tieren, und große Sorgfalt muss darauf zu achten, dass Würmer und werden vor und nach dem Training zugeführt werden. Einzel massierten Ausbildung Erträge kurzfristig assoziativen Gedächtnisses. Die erhöhte Anzahl der Konditionierung Zeiten und Abständen Schulungen Paradigma ist von entscheidender Bedeutung für die Erreichung langfristiger assoziativen Gedächtnisses in C. elegans, wie es in anderen Organismen. ^6,8 Vielleicht Assay könnte geändert werden, um langfristige Erinnerungen an Assoziationen zwischen verschiedenen bedingten und unbedingten Reize zu erzeugen.

Unsere assoziative Lernen und Gedächtnis-Tests können verwendet werden, um die Lern-und Gedächtnis-Fähigkeiten von Wildtyp Alterung oder genetische Mutanten Tieren zu vergleichen. Zum Beispiel wird während beide assoziativen Lernens und langfristigen assoziativen Gedächtnisses Fähigkeiten Rückgang der Alterung Wildtyp-Würmer, Lernen ist mehr mit dem Alter bei Tieren mit reduziertem Insulin-Signalisierung und Lernen und Gedächtnis aufrechterhalten länger mit dem Alter in kalorisch eingeschränkt Tiere gehalten. ⁶ Diese Assays sind auch zugänglich für RNAi-Behandlung oder pharmakologische Manipulation von C. elegans. Zum Beispiel verbessert die Behandlung von Würmern mit daf-2 RNAi kurz-und langfristigen assoziativen Gedächtnisses, und umgekehrt stört Blockade der Gen-Transkription und Proteinsynthese mit Drogen (Actinomycin D und Cycloheximid bezeichnet) während der Abstand Ausbildung Langzeitgedächtnis Bildung. ⁶

Das Langzeitgedächtnis ist ein Prozess, der entscheidend für das Überleben in allen Tieren ist, und es scheint, dass ein Großteil der molekularen Maschinerie in Erinnerung an einen Pawlowschen Verein beteiligt ist, von Würmern bis zu den Säugetieren konserviert. ⁶ Die Fähigkeit zu unterscheiden und zu testen assoziatives Lernen, kurz Sicht-und Langzeitgedächtnis mit diesen olfaktorischen Tests macht C. elegans ein ausgezeichnetes System für die weitere Untersuchung des Gedächtnisses, und können Einblick in neurodegenerative Prozesse, die zum Verlust von Lernen und Gedächtnis beim Menschen führen können.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Azide		Fisher Scientific	S227	Prepare 1 M concentration in distilled water
Ethyl Alcohol 190 Proof		Pharmco-Aaper	DSP-CT-18	>95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays
2-Butanone 99+%		Acros	14967-0010
Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera		Edmund Optics	NT56-683
InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial		Edmund Optics	NT56-202
Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator		Edmund Optics	NT55-718
8” x 8” Backlight		Schott Fostec	A08927
Standard Boom Stand		Edmund Optics	NT54-120
3/4” Post Adaptor for Boom Stands		Edmund Optics	NT54-124
Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate		Edmund Optics	NT54-122