सी एलिगेंस सकारात्मक Butanone लर्निंग, लघु अवधि, और लंबी अवधि के साहचर्य मेमोरी Assays

Summary

यहाँ हम तरीकों सी एलिगेंस साहचर्य सीखने और साहचर्य स्मृति लघु और लंबी अवधि के परीक्षण के लिए का वर्णन. ये आबादी assays अस्थिर odorants की ओर chemotax कीड़े क्षमताओं, रोजगार और chemoattractant butanone साथ खाना बाँधना पर सकारात्मक संघों के रूप में. कंडीशनिंग अवधियों की संख्या बढ़ाने के दीर्घकालिक स्मृति लाती है.

Abstract

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors^{1, 2}, and can associate nutritive states with chemical odors³, temperature⁴, and the pathogenicity of a food source⁵.

Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm⁶ to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.⁷). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.

After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (<40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),⁶ a transcription factor required for long-term memory across species.⁸

Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.⁹ Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.¹⁰ Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.

We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.^6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

Protocol

ये सी. एलिगेंस साहचर्य सीखने और स्मृति assays अग्रिम तैयारी की आवश्यकता होती है. तैयारी के एक सुझाव दिया अनुसूची के लिए, चित्रा 1A में प्रस्तुत समयरेखा देखें. यह भी ध्यान दें कि 'कीड़े यादें शारीरिक आंदोलन (किसी न किसी pipetting, centrifugation, vortexing) द्वारा परेशान किया जा सकता है, और है कि भोले chemotaxis वातावरण में अत्यधिक odors को (परफ्यूम, आदि) द्वारा परेशान किया जा सकता है है.

1. परख के लिए पशु की तैयारी

1. 100 मिमी उच्च विकास (HGM) मीडिया प्लेटों पर कीड़े खेती (नुस्खा के लिए धारा 7.1 देखें) 1 एमएल OP50 ई. के साथ वरीयता प्राप्त मानक तरीकों का उपयोग कर कोली ^11.
2. कम से कम दो घनी आबादी HGM प्लेटें Hypochlorite gravid वयस्क कीड़े के इलाज के लिए अंडे की एक बड़ी आबादी सिंक्रनाइज़ प्राप्त है.
   नोट: पैदावार के लिए सबसे अच्छा है, ब्लीच पहली पीढ़ी के एक अत्यधिक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या को प्राप्त करने के लिए, तो ब्लीच दिन 2 वयस्कों के रूप में दूसरी पीढ़ी के बाद के चरण के लिए अंडे प्राप्त करने के.
3. समान रूप से 3-4 HGM 1 एमएल OP50 ई. के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटों पर अंडे विभाजित प्रत्येक hypochlorite के लिए कोलाई थाली का इलाज किया.
   नोट: यह महत्वपूर्ण है कि कीड़े ताजा भोजन के साथ बहुत खेती कर रहे हैं के रूप में भुखमरी घ्राण assays के परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं.
4. 20oC पर कीड़े के बारे में 72 घंटे के लिए, समय यह लेता है के लिए पशुओं युवा वयस्क अवस्था तक पहुंचने सेते हैं.

2. प्री - कंडीशनिंग भूख से मर जाना

1. युवा वयस्कों के साथ करने के लिए सुनिश्चित करें कि कीड़े अभी भी खाना बहुत है अपने HGM प्लेटों की जांच और परख (≥ 200 कीड़े प्रति परख थाली) के लिए पर्याप्त कीड़े हैं कि डबल.
2. कीड़े धो M9 बफर के साथ ¹¹ HGM प्लेटों के 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में बंद. Washes के दौरान कम से कम आंदोलन के लिए, धीरे HGM थाली पर कुछ मिलीलीटर गिरने से M9 बफर लागू करने के लिए, और धीरे से चिपचिपा OP50 बैक्टीरिया से मुक्त कीड़े की थाली ज़ुल्फ़. अगला, थाली झुकाव, P1000 pipetman का उपयोग थाली के कोने से M9 मिश्रण / बफर कीड़ा खींच, और 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब कीड़े हस्तांतरण. यदि कीड़े अभी भी थाली पर छोड़ दिया जाता है, यह एक 2X कदम दोहराएँ.
   नोट: असहज dislodges बैक्टीरिया धोने थाली है कि कीड़े के साथ ट्यूब में यह कर सकते हैं बंद. इस बैक्टीरिया से छुटकारा पाने के असंभव है और assays के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ट्यूब के पक्ष के खिलाफ विंदुक नहीं करते कीड़े, के रूप में इस कीड़े का नुकसान और assays के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं..
3. चलो कीड़े गंभीरता से व्यवस्थित (अपकेंद्रित्र) नहीं है . वैक्यूम द्वारा सतह पर तैरनेवाला निकालें और M9 के कम से कम 3-4 एमएल के साथ धोने. 3 washes के एक कुल के लिए 2X दोहराएँ.
   नोट: washes के दौरान Centrifuging कीड़ा जनसंख्या, जो assays के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं में किसी भी शेष बैक्टीरिया नीचे खींच जाएगा. इसके बजाय, धीरे बाद के washes के लिए 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में सीधे गिरने से M9 बफर जोड़ने. ट्यूब के नीचे बसे कीड़े मिश्रित M9 बफर में इसके अलावा पर हो जाना चाहिए. यदि कीड़े बसे बने रहे, धीरे ट्यूब पलटना करने के लिए मिश्रण.
4. तीसरे धोने के बाद, भोले chemotaxis assays (धारा 5) के लिए कीड़ा जनसंख्या का कुछ का उपयोग करें.
   नोट: यह सभी धोने कदम पर काफी तेजी से काम करने के लिए महत्वपूर्ण है, के रूप में कीड़े को भूखा अगर वे M9 बफर, जो butanone ओर भोले chemotaxis में वृद्धि कर सकते हैं लंबे समय भी बैठ शुरू हो जाएगा.
5. M9 बफर के 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को 3-4 एमएल जोड़ें, कीड़े कमरे के तापमान पर M9 बफर में 1 घंटा (चित्रा 1 बी, सी) के लिए भूखा है.

3. लघु अवधि के साहचर्य मेमोरी प्रशिक्षण (जमा)

अल्पकालिक साहचर्य स्मृति परख वर्कफ़्लो के लिए चित्रा 1B देखें.

1. M9 (धारा 2) बफर, लकीर 10% butanone की 2 (95% EtOH में) 60 मिमी निमेटोड विकास (एन जी एम) मीडिया ¹¹ कि प्लेटों के साथ वरीयता प्राप्त किया गया है lids के अंदर पर μL में भूखा अवधि के अंत में 500 μL OP50 ई. कोलाई.
   नोट: छोटी और लंबी अवधि के स्मृति assays के लिए एक अच्छा प्रारंभिक आबादी ≥ 500 μL कीड़े की है. एकाधिक कंडीशनिंग प्लेटें जीनोटाइप के प्रति की जरूरत है प्रशिक्षण के दौरान संपूर्ण जनसंख्या का समर्थन. जब वाष्पशील रसायनों के साथ काम कर रहे हैं, केवल जब आवश्यक प्लेटों के lids खोलने के लिए, उन्हें अन्य सभी समय पर बंद छोड़ने.
2. 15 एमएल निर्वात द्वारा भूखे कीड़े के शंक्वाकार ट्यूब से M9 बफर सतह पर तैरनेवाला निकालें और एक P1000 कंडीशनिंग प्लेटों के कीड़े के 100-200 μL लागू pipetman का उपयोग करें.
   नोट: जितना संभव हो उतना M9 तरल निकालने की कोशिश करें, ताकि कीड़े जल्दी OP50 खाद्य स्रोत के लिए जब कंडीशनिंग प्लेटों को हस्तांतरित कर सकते हैं. कीड़े विंदुक टिप के अंदर करने के लिए छड़ी और छोटे संस्करणों pipetting द्वारा संरक्षित किया जा सकता है है.
3. कमरे के तापमान पर 1 घंटा (चित्रा 1 बी) के लिए कंडीशनिंग प्लेटें सेते हैं.
4. कीड़े बंद धो ~ 1 एमएल M9 बफर के साथ एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्लेटों की. चलो कीड़े गंभीरता से व्यवस्थित है. फिर धो एक 2X जब तक ट्यूब में M9 बफर स्पष्ट है.
   नोट: कोमल धोने खंड में वर्णित विधियों का प्रयोग करें2. वही 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब धारा 2 से इस्तेमाल किया जा सकता है.
5. अंतिम धोने के बाद, निर्वात द्वारा M9 बफर सतह पर तैरनेवाला निकालने के लिए, और chemotaxis assays के लिए कीड़ा जनसंख्या का कुछ का उपयोग करें (धारा 5) 1x के लिए परीक्षण (जमा) कंडीशनिंग के तुरंत बाद खाद्य butanone संघ के साहचर्य सीखने (0 मिनट समय बिंदु ).
   लर्निंग सूचकांक (लाइट) = CI _{0 घंटा} - सीआई _{अनुभवहीन.}
6. 60 मिमी एन जी एम OP50 के 500 μL (प्लेटों पकड़) के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटें कीड़े के शेष जनसंख्या स्थानांतरण. फिर, प्लेट प्रति कीड़े के 100-200 μL लागू करने के लिए सुनिश्चित करें वहाँ पर्याप्त जनसंख्या का समर्थन बैक्टीरिया होते हैं.
   नोट: पकड़ जीनोटाइप प्रति इस्तेमाल प्लेटों की संख्या कम से कम अल्पकालिक साहचर्य स्मृति समय परीक्षण किया जा अंक की संख्या है.
7. कमरे के तापमान (चित्रा 1 बी) में 0.5, 1, या 2 घंटे (अल्पकालिक साहचर्य स्मृति समय अंक) के लिए कंडीशनिंग के बाद प्लेटें सेते हैं.
   नोट: लघु अवधि के जंगली प्रकार के पशुओं के साहचर्य स्मृति प्रशिक्षण के बाद 2 बजे तक समाप्त होता है. समय अंक अलग जीनोटाइप या शर्तों के लिए समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है.
8. अल्पकालिक खाद्य butanone संघ के साहचर्य स्मृति के लिए परीक्षण करने के लिए, हर बार बिंदु के बाद, धीरे से एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्लेटें बंद कीड़े और धोने फिर से M9 बफर के साथ 1-2X. Chemotaxis assays (धारा 5) के लिए कीड़े का उपयोग करें. लर्निंग सूचकांक (लाइट) = सीआई _{समय बिंदु} - सीआई _{अनुभवहीन.}
   नोट: कोमल धोने धारा 2 में वर्णित विधियों का उपयोग करें. हर बार बिंदु के लिए, किसी भी अतिरिक्त कीड़े कि chemotaxis assays में इस्तेमाल नहीं कर रहे त्यागें.

4. लंबी अवधि के साहचर्य मेमोरी प्रशिक्षण (दूरी)

लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति परख वर्कफ़्लो के लिए चित्रा 1C देखें.

1. धारा 3 में 3.1-3.2 चरणों का पालन करें.
2. कमरे के तापमान पर 30 मिनट (चित्रा 1C) के लिए कंडीशनिंग प्लेटें सेते हैं.
3. धारा 3 में 3.4 कदम का पालन करें.
   नोट: एक 30 मिनट की समय सीमा के अंदर रहते हैं, एक ~ 25 मिनट में प्रशिक्षण के दौरान सभी washes शुरू कर सकते हैं.
4. अंतिम धोने के बाद, निर्वात और हस्तांतरण कीड़े द्वारा M9 सतह पर तैरनेवाला हटाने के लिए 60 मिमी एन जी एम प्लेटें गैरवरीय.
   नोट: इस कदम पर जीनोटाइप प्रति एकाधिक प्लेटों के उपयोग की आवश्यकता नहीं है के बाद से कीड़े भूखे किया जा रहा है है.
5. 30 मिनट (चित्रा 1C) के लिए कमरे के तापमान पर 60 मिमी एन जी एम प्लेटों पर भूख से मर जाना.
6. 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में M9 बफर के साथ कीड़े धो लें. चलो कीड़े गंभीरता से व्यवस्थित (अपकेंद्रित्र) नहीं है .
   नोट: जबकि वहाँ इस बिंदु पर बफर में कोई जीवाणु नहीं होना चाहिए, centrifuging कीड़े का एक संभावित हानिकारक उपचार हो सकता है, और दीर्घकालिक स्मृति गठन को बाधित कर सकते हैं कर सकते हैं.
7. दोहराएँ ब्लॉक 7 कंडीशनिंग ब्लॉक और 6 के कुल भूखा पूरा हो गया है (चित्रा 1C) तक 4.1-4.6 कई बार दोहराएँ . (एक प्रतिनिधि समय पत्रक के लिए देखें तालिका 1.)
8. धीरे प्लेटें बंद 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में कीड़े और धोने फिर M9 बफर के साथ एक 2X.
9. अंतिम धोने के बाद, chemotaxis assays (धारा 5) के लिए कीड़ा जनसंख्या का कुछ 7x के लिए उपयोग करने के लिए (स्थान दिया गया) खाद्य butanone कंडीशनिंग के तुरंत बाद संघ (0 घंटे समय बिंदु) के साहचर्य सीखने का परीक्षण. लर्निंग सूचकांक (लाइट) = CI _{0 घंटा} - सीआई _{अनुभवहीन.}
10. 100 मिमी HGM OP50 के 1 एमएल (प्लेटों पकड़) के साथ वरीयता प्राप्त प्लेटें कीड़े के शेष जनसंख्या स्थानांतरण. फिर, प्लेट प्रति कीड़े के 100-200 μL लागू करने के लिए सुनिश्चित करें वहाँ पर्याप्त जनसंख्या का समर्थन बैक्टीरिया होते हैं.
    नोट: पकड़ जीनोटाइप प्रति इस्तेमाल प्लेटों की संख्या कम से कम लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति समय परीक्षण किया जा अंक की संख्या है. 100 मिमी एन जी एम प्लेटें भी कंडीशनिंग के बाद प्लेटों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन एक बहुत सावधान होना चाहिए कि वहाँ काफी कीड़े की आबादी के लिए कम से कम 16 घंटे के लिए समर्थन OP50 है.
11. 20oC (चित्रा 1C) में 16 के लिए कंडीशनिंग के बाद प्लेटें, 24, और 40 घंटे (लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति समय अंक) सेते हैं.
    नोट: लंबी अवधि के जंगली प्रकार के पशुओं के साहचर्य स्मृति के प्रशिक्षण के बाद 40 बजे तक समाप्त होता है. समय अंक अलग जीनोटाइप या शर्तों के लिए समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है.
12. दीर्घकालिक खाद्य butanone संघ के साहचर्य स्मृति के लिए परीक्षण करने के लिए, धीरे से एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में प्लेटें बंद कीड़े और धोने फिर एक 2X-M9 बफर के साथ हर समय बिंदु के बाद. Chemotaxis assays (धारा 5) के लिए कीड़े का उपयोग करें. लर्निंग सूचकांक (लाइट) = सीआई _{समय बिंदु} - सीआई _{अनुभवहीन.}
    नोट: कोमल धोने धारा 2 में वर्णित विधियों का उपयोग करें. हर बार बिंदु के लिए, किसी भी अतिरिक्त chemotaxis assays में उपयोग नहीं किया कीड़े त्यागें.

5. Chemotaxis परख

1. Chemotaxis परख प्लेटें तैयार. नीचे और प्लेट के प्रत्येक पक्ष (2A चित्रा) पर धब्बे के साथ गैरवरीय 100 मिमी एन जी एम प्लेटों के नीचे मार्क .
   नोट: कम से कम 3 replicates जीनोटाइप प्रति सांख्यिकीय महत्वपूर्ण परिणाम प्राप्त करने के लिए चला जाना चाहिए.
2. स्पॉट odorant में 1 1 एम ₃ NaN की μLनियंत्रण स्थान (चित्रा 2B).
   नोट: हाजिर परख शुरू करने से पहले अधिक से अधिक 15 मिनट paralyzing एजेंट के साथ अपने प्लेटें, _या NaN तीन स्थानों से दूर फैलाना, और जानवरों odorant या नियंत्रण स्थलों तक पहुँचने से पहले रुक हो जाएगा मत करो. अगर पंचर जब कीड़े हवा निकाल क्षेत्रों में बिल के बाद _से NaN 3 आवेदन नहीं सावधान रहो.
3. जबकि कई M9 (धारा 2) बफर washes, हाजिर 1 μL 95% EtOH के प्रत्येक और 10% butanone के बाद कीड़े शंक्वाकार ट्यूब में व्यवस्थित कर रहे हैं (खंड 7.2 देखें) पर चिह्नित परख थाली पर उपयुक्त स्पॉट (चित्रा 2C) पहले से देखा NaN 3 के शीर्ष.
   नोट: रसायन पहले देखा जाना चाहिए कीड़े (5.4 धारा) को जोड़ने. एक नोट जो की हाजिर EtOH या butanone. जब इन वाष्पशील रसायनों के साथ काम कर रहे, केवल जब आवश्यक प्लेटों के lids खोलने के लिए सावधान रहना, और उन्हें अन्य सभी समय पर बंद रखना.
4. बस कीड़े की ट्यूब से M9 बफर के रूप में संभव के रूप में में ज्यादा निकालें. एक पूर्व में कटौती (खंड 7.3 देखें) टिप के लिए चिह्नित परख प्लेट (चित्रा 2 डी) की उत्पत्ति के लिए 3X 5 μL कीड़े (200-400 पशुओं) देने के साथ एक P20 pipetman का प्रयोग करें.
   नोट: 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में भूख से मर जाना और स्मृति assays (2-4 अनुभाग) प्री - कंडीशनिंग में उपयोग के लिए शेष कीड़े रखें. कीड़े विंदुक युक्तियाँ के अंदर रहना है, तो थाली करने के लिए छोटी मात्रा में कीड़े जोड़ने जाएगा अपनी कीड़ा जनसंख्या संरक्षण और तरल कि परख थाली पर कीड़े के साथ जारी किया जाता है की राशि कम कर देता है.
5. एक छोटी सी बात के लिए एक KimWipe के कोने ट्विस्ट और इसका इस्तेमाल करने के लिए अतिरिक्त M9 बफर दाग. यह परख प्लेट (चित्रा 2 ई) पर कीड़े जारी करेंगे.
   नोट: KimWipe साथ अगर पंचर नहीं सावधान रहो, अन्यथा कीड़े मूल में बिल. कुछ कीड़े इस चरण में खो दिया जा सकता है के रूप में वे KimWipe में M9 बफर के साथ खींच रहे हैं जब सोख्ता. यदि इमेजिंग और विश्लेषण का उपयोग करने के लिए कीड़े (धारा 6) गिनती, मूल से कीड़े जारी करने से पहले इमेजिंग स्टेशन प्लेटें ले. तुरंत रिहाई के बाद मूल में कीड़े की एक छवि एक परख की थाली के लिए पशुओं की कुल संख्या देंगे.
6. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए chemotaxis परख थाली सेते हैं.
7. मूल, EtOH में कीड़े की संख्या की गणना, और butanone (चित्रा 2) के धब्बे, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से परख थाली पर कीड़े की कुल संख्या.
   नोट: आम तौर पर, ₃ NaN से झोले के मारे हुए कीड़े ~ 1 स्पॉट के सेमी त्रिज्या के भीतर, और कई जानवरों के साथ एक दूसरे के खिलाफ खड़ी छड़ी सीधे दिखाई देगा . यदि इमेजिंग और विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करने के लिए कीड़े (धारा 6) गिनती, मूल, EtOH, और butanone स्पॉट की छवियों को ले लो. कीड़े की कुल राशि की एक छवि खंड 5.5 में किया गया है लिया जाना चाहिए. कीड़े भी हो सकता है "हाथ में गिना है." किया जा सकता है
8. "Chemotaxis सूचकांक (CI) की गणना. सीआई = ([(n) _Butanone - (n _EtOH )]/[( कुल-n _{उत्पत्ति)]}

6. छवि विश्लेषण द्वारा गिनती कृमि

1. उच्च विपरीत chemotaxis परख प्लेट (चित्रा 3A कैमरा सेटअप का वर्णन करने के लिए धारा 7.4 देखें) पर कीड़े के काले और सफेद छवियाँ ले लो. Chemotaxis सूचकांक की गणना करने के लिए, छवियों butanone, EtOH पर की जरूरत है, और एक chemotaxis परख थाली के एक परख के अंत में मूल धब्बे, के रूप में अच्छी तरह के रूप में कीड़े की कुल संख्या (मूल में कीड़े की तस्वीर के तुरंत बाद से वे जारी कर रहे हैं परख की शुरुआत में M9 बफर, खंड 5.5).
   नोट: chemotaxis परख के बारे में प्रत्येक स्थान के चारों ओर एक 2 सेमी त्रिज्या कवर प्लेटों की छवियाँ आम तौर पर प्रत्येक स्थान के लिए पशुओं के सभी कब्जा.
2. सुनिश्चित करें कि एक समय बिंदु (उदाहरण के अनुभवहीन, 0 घंटे, आदि) के सभी परीक्षणों के लिए फ़ाइलें एक फ़ोल्डर में समाहित कर रहे हैं, उचित नाम.
3. प्रत्येक chemotaxis प्लेट के लिए फ़ाइलें जैसे नाम होना चाहिए: # लेकिन png (butanone हाजिर, परीक्षण #), मूल (मूल, परीक्षण #) # png, और भी eth # png (इथेनॉल हाजिर, परीक्षण #), मुन्ना # png... (कुल परीक्षण #). (उदाहरण के लिए, अगर दो परीक्षणों एक समय बिंदु के लिए चलाए जा रहे थे, उसी फ़ोल्डर में निम्न फ़ाइलें मौजूद होगा: but1.png but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 png, tot2.png)
4. ओपन Matlab (खंड 7.5 देखें).
5. Matlab खिड़की के शीर्ष पर "वर्तमान निर्देशिका" पंक्ति में, फ़ोल्डर के लिए ब्राउज़ करें, और "count_worms_v0.5.3" फ़ोल्डर (एम फ़ाइलें पूरक सूचना के रूप में उपलब्ध) का चयन करें.
6. "कमांड विंडो" में, प्रकार "(count_worms_directory)." दर्ज मारो.
   नोट: डिफ़ॉल्ट कृमि आकार जब इस आदेश के लिए 10 मिनट, अधिकतम 80 पिक्सल है. एक विशिष्ट जीनोटाइप या विकास मंच, प्रकार "count_worms_directory ('minsize', 10 'maxsize', 80)" और पिक्सेल संख्या तदनुसार बदल के आधार पर समायोजित करने के लिए.
7. जब संकेत किया जाए, तो छवियों के फ़ोल्डर का विश्लेषण करने के लिए चुनते हैं.
   नोट: केवल छवियों का एक फ़ोल्डर एक समय में विश्लेषण किया जा सकता है.
8. विश्लेषण किया जा रहा फ़ोल्डर में प्रत्येक छवि एक पहले से ही सेट दहलीज के साथ पॉप, और कणों चयनित (चित्रा 3A). चयनित कणों कि कीड़े वें नष्ट नहीं कर रहे हैं पर आयत उपकरण खींचेंउन्हें. जब छवि के साथ समाप्त, Esc कुंजी मारा.
9. उसके बाद फ़ोल्डर में सभी छवियों की जाँच कर रहे हैं, 4 कॉलम कमान विंडो में दिखाई देगा: (1) छवि नाम (but1 उदाहरण), (2) हमेशा "[1]," (3) एक कीड़ा द्वारा गणना के लिए औसत पिक्सेल आकार विशेष छवि कार्यक्रम, और (4) छवि में होने की गणना कीड़े की संख्या.
10. एक बार इस कार्यक्रम को चलाने की है, यह दो जमा csv (एक्सेल स्प्रेडशीट के रूप में खोला जा सकता है) यह सिर्फ विश्लेषण किया गया है छवियों के फ़ोल्डर में फ़ाइलें. जाएगा. "Worm_counts_stats" फ़ाइल उत्पादन कमान विंडो (खंड 6.9) में पाया स्तंभों प्रदान करता है. (1) परीक्षण संख्या, संख्या में कीड़े के (2), लेकिन (3) eth, और (4) मूल स्पॉट, और (5) कीड़े की कुल संख्या: "worm_counts_summary" फ़ाइल 5 स्तंभों प्रदान करता है.

7. सामग्री नोट्स

1. 100 मिमी उच्च विकास (HGM) मीडिया प्लेटें (धारा 1) को तैयार: 3 जी NaCl, 20 छ Bactopeptone, और 30 700 एमएल आसुत पानी में Bacto अगर छ भंग. आसुत जल के साथ एक एल मात्रा लाओ. 65oC करने के लिए, शांत अगर autoclaving और इथेनॉल में 5 मिलीग्राम / एमएल कोलेस्ट्रॉल के 4 एमएल जोड़ने के बाद, 1 एमएल एम ₁ 2 CaCl, 1 एम _MgSO 4, और 1 _एम 4 केपीओ (= पीएच 6.0) के 25 एमएल के प्रत्येक .
2. 95% EtOH प्रयोग किया जाता है, के रूप में उच्च प्रतिशत EtOH शुद्धिकरण प्रक्रिया है कि परिणाम को प्रभावित कर सकते हैं से दोष होते जाता है. यह ताजा हर बार कुछ परख चलाया जाता है ऊपर 10% (95% EtOH में) butanone स्टॉक बनाने के लिए एक अच्छा विचार है.
3. P20 सुझावों कुछ मिलीमीटर काट क्षतिग्रस्त किया जा रहा बिना कीड़े माध्यम से फिट करने के लिए एक छेद बड़ा पर्याप्त बनाने चाहिए. P1000 सुझावों को पहले से ही काफी बड़े कीड़े के लिए के माध्यम से फिट करने के लिए छेद है.
4. chemotaxis परख मर्फी प्रयोगशाला में थाली इमेजिंग स्टेशन (3B चित्रा) एक चर बढ़ाई एक बूम स्टैंड से जुड़ी लेंस के साथ एक FireWire कैमरा शामिल हैं. एक backlight के एक गिलास शीर्ष (चित्र 3C), जो chemotaxis परख प्लेटें नीचे से प्रबुद्ध करने की अनुमति देता है के साथ एक कस्टम इमेजिंग मंच के नीचे खड़े के नीचे पर रखा गया है. "मापन और स्वचालन सॉफ्टवेयर (नेशनल इंस्ट्रूमेंट्स) छवियों पर कब्जा करने के लिए प्रयोग किया जाता है. इस इमेजिंग स्टेशन के लिए सामग्री स्थापित पहले प्रकाशित उन, ¹² के लिए समान हैं और विशिष्ट अभिकर्मकों और उपकरणों की तालिका में पाया जा सकता है.

8. प्रतिनिधि परिणाम:

एक ठेठ 10% butanone के लिए जंगली प्रकार के कीड़े के लिए भोले chemotaxis सूचकांक (CI) 0.2 (4A चित्रा) ^के आसपास है 6 (1x) जमा या स्थान दिया गया. प्रशिक्षण (7x) आम तौर पर 0.7-0.8 0 समय chemotaxis सूचकांक (चित्रा बढ़ जाती है 4A, सीडी) देने के लिए एक सीखने सूचकांक (लाइट = प्रशिक्षित सीआई है - 0.6 ~ भोले ^{सीआई)} 6 सीखने की है कि जमा या स्थान प्रशिक्षण के साथ होता है, बहुत मजबूत है.. कम से कम 0.5 की एक लाइट आम तौर पर उठता है, जब वहाँ भोले chemotaxis परख के साथ समस्याओं कर रहे हैं, और जानवरों 0.3 या उच्चतर की एक अनुभवहीन सीआई है. आमतौर पर, यह तब होता है क्योंकि कीड़े या भूख से मर भी विरंजन और परख की शुरुआत, या कीड़े के बीच खेती प्लेटों पर भीड़ भी लंबे समय बैठो M9 washes के बीच बफर में और भूखा शुरू, पर्यावरण odors को भी भोले सीआई को बढ़ा सकते हैं. भूखे कीड़े 10% butanone के लिए एक बहुत उच्च भोले सीआई (4B ^{चित्रा)} 6. हम पाते हैं कि भोले chemotaxis के साथ समस्याओं को आम तौर पर सुधार कीड़ा देखभाल और संवर्धन के साथ हल कर रहे हैं.

इन assays में स्मृति की अवधि के समय यह chemotaxis अनुक्रमणिका के लिए तुरंत बाद प्रशिक्षण भोले के स्तर पर लौटने के लिए लेता है, जब सीखने सूचकांक = 0 है. जंगली प्रकार के पशुओं में, अल्पकालिक स्मृति साहचर्य आम तौर पर 1 घंटे के द्वारा जमा प्रशिक्षण के बाद गिरावट शुरू होता है, के बारे में 2 घंटे तक रहता है, और प्रतिलेखन कारक CREB (चित्रा ^4C) की स्वतंत्र है 6 लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति आम तौर पर शुरू नहीं करता है. काफी गिरावट आई है जब तक स्थान प्रशिक्षण के बाद 16 घंटे, 40 घंटे तक रहता है, और CREB पर निर्भर (चित्रा ^4D) 6 लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति कई मामलों में अपनी पूरी क्षमता तक नहीं पहुँच सकते हैं: (1) कीड़े पर्याप्त नहीं है. OP50 ई. 30 मिनट कंडीशनिंग अवधि के दौरान कोली, (2) बैक्टीरिया भुखमरी अवधि के दौरान M9 बफर में रहते हैं, या (3) कीड़े परख (जैसे कीड़े ट्यूब के पक्ष के खिलाफ pipetted हैं) के दौरान क्षतिग्रस्त हो रहे हैं.

परिणाम आम तौर पर कर रहे हैं सांख्यिकीय महत्वपूर्ण है जब 4 या अधिक chemotaxis परख परीक्षण समय बिंदु प्रति जीनोटाइप प्रति चलाए जा रहे हैं. छह रनिंग जीनोटाइप प्रति replicates आमतौर पर बहुत संभाल करने के लिए बनने के बिना बहुत महत्वपूर्ण परिणाम पैदावार, लेकिन, शुरुआती केवल तीन प्रतिकृति के साथ शुरू करना चाहते हो सकता है. आम तौर पर, एक समय में 2-3 जीनोटाइप या शर्तों के साथ काम जो इन assays सीखने और स्मृति के साथ अनुभव कर रहे हैं के लिए सहज है.

Chemotaxis परख प्लेटों पर हाथ से गिनती कीड़े बहुत समय लगता है, प्रयोगों या प्रयोगशाला साथी के बीच परिवर्तनशीलता जोड़ने के लिए, और भी biases परिचय हो सकता है जब विश्लेषण और मैं कर सकते हैंडेटा nterpreting. छवि विश्लेषण (धारा 6) द्वारा गिनती इल्ली प्रयोगशाला भर में डेटा संग्रह और विश्लेषण मानकीकरण, और औसत पर, / 5 1 हाथ गिनती के लिए आवश्यक है कि अनुभवी सदस्यों के लिए प्रयोगशाला डेटा विश्लेषण के समय में कटौती. जब chemotaxis Count_worms सॉफ्टवेयर द्वारा निर्धारित उन लोगों के लिए मैनुअल कीड़ा मायने रखता का उपयोग कर की गणना सूचकांक की तुलना में, हम 3.07 की एक औसत त्रुटि (± 1.19%) लगता है.

दिवस 1
समय	चरण
9:00	1 घंटे M9 बफर में भूखा भोले chemotaxis परख प्रारंभ
10:00	# (भोजन और butanone के साथ 60 मिमी एन जी एम प्लेटें) 1, 30 मिनट की हालत अंत भोले chemotaxis परख
10:30	# (60 मिमी एन जी एम प्लेटें) 1, 30 मिनट भूख से मर जाना
11:00	हालत # 2, 30 मिनट
11:30	# 2 भूखे रहते हैं, 30 मिनट
12:00	हालत # 3, 30 मिनट
12:30	# 3 भूखे रहते हैं, 30 मिनट
1:00	हालत # 4, 30 मिनट
1:30	# 4 भूखे रहते हैं, 30 मिनट
2:00	# 5 हालत, 30 मिनट
2:30	# 5, 30 मिनट भूख से मर जाना
3:00	हालत # 6, 30 मिनट
3:30	# 6 भूखे रहते हैं, 30 मिनट
4:00	# 7 हालत, 30 मिनट
4:30	0-घंटा chemotaxis परख शुरू शेष कीड़े स्थानांतरण 16-40 बजे के लिए प्लेटें पकड़
5:30	0-घंटा एंड chemotaxis परख
2 दिन
समय	चरण
8:30	16 घंटा chemotaxis परख शुरू
9:30	समाप्ति 16 घंटा chemotaxis परख

तालिका 1 प्रतिनिधि लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति परख के लिए अनुसूची . इस उदाहरण में, परख 1 दिवस के अवसर पर 9 बजे एक 1 घंटा के साथ भूखा शुरू होता है. 30 मिनट शर्त और अवधि भूखा जब तक कीड़े सात बार वातानुकूलित किया गया है alternated हैं. Chemotaxis assays (अनुभवहीन) शुरुआत और प्रशिक्षण (0 घंटा) के अंत में चलाए जा रहे हैं. शुरू से आखिर तक चलाने के समय कुल 8.5 घंटे है. पकड़ प्लेटों पर कीड़े 2 दिवस पर 16-40 घंटे के प्रशिक्षण के बाद शुरू butanone chemotaxis के लिए परीक्षण कर रहे हैं.

चित्रा 1 लघु अवधि और लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति परख कार्यप्रवाह. (ए) दिन assays के लिए अग्रणी तैयारी की सिफारिश समयरेखा प्रदर्शन कर रहे हैं. (बी) लघु अवधि के साहचर्य स्मृति परख: 1 घंटे के लिए भूखे कीड़े वातानुकूलित हैं और 1x (0 मिनट.) सीखने के लिए तुरंत chemotaxis assays के माध्यम से परीक्षण, या भोजन के साथ पकड़े प्लेटों पर कंडीशनिंग के बाद 0.5, 1, या 2 घंटे के लिए स्थानांतरित. (सी) लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति परख: भूखे पशुओं 7 कंडीशनिंग के ब्लॉक का प्रशिक्षण प्राप्त / सीखने या 16-40 घंटे के प्रशिक्षण के बाद LTAM के लिए परीक्षण किया किया जा रहा से पहले भूख से मर.

चित्रा 2 chemotaxis परख सेटअप. (ए) chemotaxis परख थाली के योजनाबद्ध. छोटे धब्बे एक शासक या अन्य डिवाइस का मार्गदर्शन करने के लिए मूल (नीचे) और butanone और EtOH थाली पर स्पॉट (बाएँ और दाएँ) के निशान की मदद के साथ थाली करने के लिए जोड़ रहे हैं. (बी) 1 μL ₃ NaN butanone और EtOH स्पॉट करने के लिए जोड़ा जाता है. (सी) 1 μL 10% और 95% butanone EtOH प्रत्येक थाली के बाईं या दाईं ओर पर धब्बे जोड़ रहे हैं. (डी) 200-400 M9 बफर में निलंबित कीड़े थाली के मूल करने के लिए जोड़ रहे हैं. (ई) एक बिंदु में मुड़ KimWipe परख थाली पर M9 बफर और रिलीज कीड़े को अवशोषित करने के लिए प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 3 छवि विश्लेषण के साथ गिनती इल्ली. (ए) "count_worms_v0.5.3" छवि कण चयन खिड़की का उदाहरण है. कार्यक्रम मूल उच्च विपरीत काले और सफेद छवि (बाएं) स्वचालित रूप से एक thresholded छवि (मध्य) के साथ एक खिड़की को चबूतरे को खोलता है. आयत उपकरण पर प्रकाश डाला और अवांछित गैर कीड़ा परख थाली के निशान (1), थाली किनारों (2), या अगर punctures (3) के रूप में ", कण को ​​खत्म करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. (बी) मर्फी प्रयोगशाला chemotaxis परख इमेजिंग स्टेशन की छवि. Chemotaxis परख प्लेटें नीचे से प्रकाशित कर रहे हैं करने के लिए उच्च विपरीत चित्र बनाने के विश्लेषण के लिए आवश्यक है. (सी) कस्टम बनाया योजनाबद्धइमेजिंग मंच chemotaxis इमेजिंग स्टेशन में प्रयोग किया जाता है.

चित्रा 4 ठेठ साहचर्य सीखने और स्मृति परिणाम. (ए) 10% जमा पर butanone बढ़ जाती है (1x) प्रशिक्षण जंगली प्रकार के कीड़े के भोले chemotaxis सूचकांक. सीखा संघ (OP50 ई. कोलाई) भोजन और butanone बाँधना की आवश्यकता है . सलाखों के ऊपर नंबर "लर्निंग सूचकांक" (- सीआई _{अनुभवहीन} लाइट = CITrained) का प्रतिनिधित्व करते हैं. (बी) जंगली प्रकार 10% butanone करने के लिए अनुभवहीन chemotaxis बहुत बढ़ जाती है जब कीड़े को 16 घंटे के लिए भूखे हैं. पैनलों ई. कॉफ़मैन एट अल से अनुकूलित कर रहे हैं. 2010 ⁶ (सी) जंगली प्रकार अल्पकालिक साहचर्य स्मृति के बारे में 2 घंटे तक रहता है, और प्रतिलेखन कारक CREB की स्वतंत्र है. (डी) जंगली प्रकार के लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति के बारे में 40 घंटे तक रहता है, और CREB पर निर्भर है.

पूरक जानकारी

• "Imoverlay.m" फ़ाइल के लिए यहाँ क्लिक करें.
• "Count_worms_image.m" फ़ाइल के लिए यहाँ क्लिक करें.
• "Count_worms_directory.m" फ़ाइल के लिए यहाँ क्लिक करें.
• "Cellwrite.m" फ़ाइल के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

सी. एलिगेंस घ्राण साहचर्य सीखने और स्मृति assays यहाँ जमा सीखने, स्थान सीखने, अल्पकालिक स्मृति, और दीर्घकालिक स्मृति की प्रक्रिया के बीच अंतर को प्रस्तुत किया . ये assays 'कीड़े की क्षमता पर भरोसा करने के लिए अपने ^{वातावरण} 1,2 में भोजन और रासायनिक odors भावना और दोनों के बीच सकारात्मक संघों ^के फार्म 6 .. इसलिए, assays बहुत पशुओं के शुरू जनसंख्या में भुखमरी प्रति संवेदनशील हैं, और महान देखभाल करना चाहिए करने के लिए सुनिश्चित करें कि कीड़े अच्छी तरह से पहले और बाद में प्रशिक्षण तंग आ चुके हैं करने के लिए ले लिया. एकल जमा अल्पकालिक प्रशिक्षण साहचर्य स्मृति पैदावार. कंडीशनिंग समय और स्थान प्रशिक्षण प्रतिमान की संख्या में वृद्धि सी. में दीर्घकालिक स्मृति साहचर्य प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है के रूप में इसे अन्य जीवों में है एलिगेंस ^6,8. शायद इस परख अलग वातानुकूलित और असुविधाजनक उत्तेजनाओं के बीच संघों के दीर्घकालिक यादों का उत्पादन करने के लिए संशोधित किया जा सकता है.

हमारे साहचर्य सीखने और स्मृति assays के बुढ़ापे या आनुवंशिक उत्परिवर्ती पशुओं के जंगली प्रकार के सीखने और स्मृति क्षमताओं की तुलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. उदाहरण के लिए, जबकि दोनों साहचर्य सीखने और लंबी अवधि के जंगली प्रकार के कीड़े उम्र बढ़ने में साहचर्य स्मृति क्षमताओं गिरावट, सीखने अब पशुओं में कम इंसुलिन संकेतन, और सीखने और स्मृति के साथ उम्र के साथ बनाए रखा है अब उम्र के साथ बनाए रखा है calorically प्रतिबंधित पशुओं ^में 6 . ये assays भी आरएनएआई उपचार या सी. के औषधीय हेरफेर करने के लिए उत्तरदायी हैं एलिगेंस. उदाहरण के लिए, आरएनएआई daf-2 के साथ कीड़े के उपचार के लघु और लंबी अवधि के साहचर्य स्मृति में सुधार, इसके विपरीत, जीन प्रतिलेखन और स्थान प्रशिक्षण के दौरान दवाओं के साथ प्रोटीन संश्लेषण (actinomycin डी और cycloheximide, क्रमशः) की रुकावट दीर्घकालिक स्मृति गठन को बाधित. ⁶

लंबी अवधि के स्मृति है एक प्रक्रिया है कि सभी जानवरों में अस्तित्व के लिए महत्वपूर्ण है, और यह है कि आणविक एक Pavlovian संघ की स्मृति में शामिल मशीनरी के बहुत लगता है कि स्तनधारियों के लिए ^{कीड़े से} संरक्षित 6. भेद और साहचर्य सीखने का परीक्षण करने की क्षमता, कम सी. अवधि और लंबी अवधि के स्मृति इन घ्राण assays का उपयोग बनाता है स्मृति के आगे के अध्ययन के लिए एक उत्कृष्ट सिस्टम एलिगेंस, और neurodegenerative प्रक्रियाओं है कि मनुष्यों में सीखने और स्मृति के नुकसान के लिए नेतृत्व में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Azide		Fisher Scientific	S227	Prepare 1 M concentration in distilled water
Ethyl Alcohol 190 Proof		Pharmco-Aaper	DSP-CT-18	>95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays
2-Butanone 99+%		Acros	14967-0010
Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera		Edmund Optics	NT56-683
InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial		Edmund Optics	NT56-202
Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator		Edmund Optics	NT55-718
8” x 8” Backlight		Schott Fostec	A08927
Standard Boom Stand		Edmund Optics	NT54-120
3/4” Post Adaptor for Boom Stands		Edmund Optics	NT54-124
Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate		Edmund Optics	NT54-122