C. elegans Learning Positivo Butanone, a breve termine e lungo termine saggi di memoria associativa

Summary

Qui si descrivono i metodi per testare C. elegans apprendimento associativo e di breve e lungo termine della memoria associativa. Questi test popolazione impiegare le capacità worm per chemiotassi verso odoranti volatili, e la forma associazioni positive su di abbinamento cibo con il butanone chemoattractant. Aumentare il numero di periodi di condizionamento induce memoria a lungo termine.

Abstract

Il ricordo di esperienze e di informazioni apprese è fondamentale per gli organismi di fare delle scelte che gli aiuti la loro sopravvivenza. C. elegans naviga il suo ambiente attraverso neurone-specifica rilevazione degli odori alimentari e chimiche ^{1, 2,} e può associare gli stati nutritivo con odori chimici ^3, temperatura ^4, e la patogenicità di una fonte di cibo ^5.

Qui, descriviamo saggi di C. elegans apprendimento associativo e di breve e lungo termine della memoria associativa. Abbiamo modificato un paradigma avversiva olfattivo di apprendimento ⁶ a produrre invece una risposta positiva, il test coinvolge affamati ~ 400 vermi, poi alimentare i vermi, alla presenza del neurone-AWC percepito butanone volatili chemoattractant ad una concentrazione che provoca un basso indice chemiotattico (simile a Toroyama et al. ^7). Una popolazione standard chemiotassi assay1 test di attrazione dei worm 'al odorizzante immediatamente o minuti a ore dopo il condizionamento.

Dopo chemiotassi condizionata, wild-type animali 'ad aumenti butanone ~ 0,6 chemiotassi unità di indice, il suo "Indice di apprendimento". Apprendimento associativo dipende dalla presenza di cibo e butanone durante l'allenamento. Abbinamento cibo e butanone per un periodo di condizionamento singolo ("formazione ammassati") produce memoria a breve termine associativa che dura circa 2 ore. Periodi di condizionamento multipli con periodi di riposo tra ("formazione distanziati") rendimenti a lungo termine della memoria associativa (<40 ore), e dipende dalla proteina cAMP Response Element Binding (CREB), ⁶ un fattore di trascrizione necessari per la memoria a lungo termine attraverso specie ^8.

Il nostro protocollo comprende anche i metodi di analisi delle immagini per la determinazione rapida e precisa degli indici chemiotassi. Immagini ad alto contrasto di animali su piastre saggio chemiotassi vengono catturati e analizzati dal software verme conteggio in MatLab. Il software corregge per lo sfondo non uniforme utilizzando una trasformazione morfologica tophat. Metodo ⁹ Otsu viene quindi utilizzato per determinare una soglia di vermi separati dallo sfondo. ¹⁰ particelle molto piccole vengono rimosse automaticamente e più grandi non-vite senza fine regioni (bordi piastra o pugni agar) sono rimosso dalla selezione manuale. Il software stime allora la dimensione del singolo verme, ignorando le regioni che si trovano sopra una dimensione massima specificata e prendendo la dimensione media delle restanti regioni. Il numero di worm è poi determinato dividendo l'area totale occupata dal identificata come vermi dalle dimensioni stimato di un singolo verme.

Abbiamo scoperto che l'apprendimento e la breve e memoria a lungo termine possono essere distinti, e che questi processi condividono simili molecole chiave con organismi superiori. ^6,8 nostro test può rapidamente testare geni candidati romanzo o molecole che influenzano l'apprendimento e la breve oa lungo termine di memoria in C. elegans che sono rilevanti tra le specie.

Protocol

Queste C. elegans apprendimento associativo e test di memoria richiedono una preparazione anticipata. Per un programma suggerito di preparazione, vedere la cronologia presentata nella Figura 1A. Si noti inoltre che i ricordi vermi 'può essere disturbato da agitazione fisica (pipettaggio ruvido, centrifugazione, vortex), e che chemiotassi ingenuo può essere perturbato da odori eccessivo (profumi, ecc) nell'ambiente.

1. Preparazione degli animali da saggio

1. Coltivate worm su 100 mezzi di crescita mm (HGM) piastre (vedi Sezione 7.1 per ricetta), testa di serie con 1 ml OP50 E. coli utilizzando metodi standard ^11.
2. Ipoclorito-trattare almeno due piatti HGM densamente popolata di vermi adulti gravido di ottenere una vasta popolazione sincronizzata di uova.
   Nota: Per ottenere i migliori rendimenti, candeggina la prima generazione di ottenere una popolazione altamente sincronizzato, poi candeggina la seconda generazione come il giorno 2 adulti per ottenere le uova per la fase successiva.
3. Uniformemente dividere le uova su piastre HGM 3-4 teste di serie con 1 ml OP50 E. coli per ciascuna di ipoclorito di trattati piatto.
   Nota: è importante che i vermi sono coltivati ​​con abbondanza di cibi freschi come la fame può influenzare l'esito del test olfattivi.
4. Incubare i vermi a 20 ° C per circa 72 ore, il tempo necessario per gli animali raggiungono lo stadio di giovane adulto.

2. Precondizionamento Starve

1. Verificate bene il vostro piatti HGM con i giovani per assicurarsi che i vermi hanno ancora un sacco di cibo, e che ci sono i vermi sufficiente per l'analisi (≥ 200 vermi per piastra saggio).
2. Lavare i vermi off di piatti HGM con M9 tampone ¹¹ in un tubo da 15 ml. Per i meno agitazione durante i lavaggi, applicare delicatamente il buffer M9 versando pochi millilitri sulla piastra HGM, e capovolgere delicatamente il piatto di vermi liberi dal appiccicoso OP50 batteri. Avanti, inclinare il piatto, sollevare il buffer / worm M9 miscela da un angolo della piastra con un P1000 Pipetman, e trasferire i vermi al tubo da 15 ml. Se il worm sono ancora a sinistra sulla piastra, ripetere questo passaggio 1-2X.
   Nota: Rough lavaggio rimuove batteri fuori della piastra che può fare nel tubo con i vermi. Questo batterio è impossibile sbarazzarsi di e può interferire con il test. NON pipetta worm contro la parete del tubo, in quanto ciò potrebbe danneggiare i vermi e interferire con il test.
3. Lasciate che i vermi risolvere per gravità (NON centrifuga). Rimuovere il surnatante tramite aspirazione e lavare con almeno 3-4 ml di M9. Ripetere 2X per un totale di 3 lavaggi.
   Nota: durante i lavaggi centrifugazione tirerà giù i batteri restanti nella popolazione worm, che possono interferire con i test. Invece, aggiungere delicatamente M9 buffer per i lavaggi successivi da versare direttamente nel tubo da 15 ml. Worms si stabilirono nella parte inferiore del tubo dovrebbe diventare miste nel buffer M9 al momento della sua aggiunta. Se il worm è rimasto costante, capovolgere delicatamente il tubo per mescolare.
4. Dopo il terzo lavaggio, utilizzare una parte della popolazione verme per ingenui saggi di chemiotassi (sezione 5).
   Nota: E 'fondamentale lavorare abbastanza rapidamente in tutte le fasi di lavaggio, i worm inizierà a morire di fame se si siedono troppo a lungo in M9 tampone, che può aumentare la chemiotassi ingenuo verso butanone.
5. Aggiungere 3-4 ml di tampone M9 al tubo da 15 ml, per non morire di fame i vermi nel buffer M9 a temperatura ambiente per 1 ora (Figura 1B, C).

3. A breve termine memoria associativa (ammassati) Formazione

Vedi Figura 1B a breve termine del flusso di lavoro associativo test di memoria.

1. Al termine del periodo di morire di fame in M9 tampone (sezione 2), si depositano su 2 ml di 10% butanone (nel 95% EtOH) sulla parte interna delle palpebre di 60 millimetri di crescita dei media nematode (NGM) ¹¹ piatti che sono stati seminati con 500 microlitri OP50 E. coli.
   Nota: Una popolazione di partenza per i test di memoria a breve e lungo termine è ≥ 500 ml di vermi. Piastre di condizionamento sono necessari più per genotipo per sostenere la popolazione durante l'allenamento. Quando si lavora con sostanze chimiche volatili, aperto solo coperchi delle piastre in caso di necessità, lasciandoli chiusi in tutti gli altri.
2. Rimuovere il surnatante tampone M9 dal tubo 15 ml conica di vermi affamati di vuoto e utilizzare un P1000 Pipetman di applicare 100-200 ml di vermi alle piastre di condizionamento.
   Nota: Provare a rimuovere quanto più liquido M9 possibile, in modo che il worm può rapidamente arrivare alla fonte di cibo OP50 una volta trasferiti i piatti di condizionamento. I vermi si attaccano alla parte interna del puntale e può essere conservato pipettando volumi più piccoli.
3. Incubare le piastre condizionata a temperatura ambiente per 1 ora (Figura 1B).
4. Lavare i vermi off di piatti con ~ 1 ml M9 tampone in una provetta da 15 ml conica. Lasciate che i vermi risolvere per gravità. Lavare nuovamente 1-2X M9 fino a tampone nel tubo è chiaro.
   Nota: utilizzare i metodi di lavaggio delicato descritto nella Sezione2. Lo stesso tubo 15 ml conica può essere utilizzato dalla sezione 2.
5. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere il supernatante tampone M9 dal vuoto, e utilizzare una parte della popolazione vite senza fine per le prove chemiotassi (sezione 5) per verificare 1x (ammassati) apprendimento associativo del cibo-butanone associazione subito dopo il condizionamento (0 punti Tempo minuti ).
   Apprendimento Index (LI) = _{0 ore} CI - CI _Naive.
6. Trasferire il restante popolazione di vermi piatti a mm 60 NGM seminato con 500 ml di OP50 (hold piastre). Anche in questo caso, applicare 100-200 ml di vermi per piastra al fine di evitare batteri abbastanza per sostenere la popolazione.
   Nota: il numero di piastre utilizzate per tenere genotipo è almeno il numero di breve termine, i punti associativi tempo di memoria da testare.
7. Incubare post-condizionamento piastre per 0,5, 1 o 2 ore (a breve tempo di memoria associativa punti) a temperatura ambiente (Figura 1B).
   Nota: memoria a breve termine associativa di tipo selvaggio animali finisce per 2 ore dopo l'allenamento. Punti di tempo potrebbe essere necessario aggiustare di genotipi differenti o condizioni.
8. Per verificare a breve termine memoria associativa del cibo-butanone associazione, dopo ogni punto di tempo, lavare delicatamente worm via piastre in un tubo da 15 ml e di nuovo 1-2X con tampone M9. Utilizzare i vermi per le prove chemiotassi (sezione 5). Apprendimento Index (LI) = CI _{punto Time} - CI _Naive.
   Nota: utilizzare i metodi di lavaggio delicato descritto nella Sezione 2. Per ogni punto di tempo, scartare qualsiasi vermi extra che non vengono utilizzati nei test chemiotassi.

4. A lungo termine della memoria associativa (Spaced) Formazione

Vedi Figura 1C a lungo termine del flusso di lavoro associativo test di memoria.

1. Seguire i passi 3,1-3,2 nella sezione 3.
2. Incubare le piastre condizionata a temperatura ambiente per 30 minuti (Figura 1C).
3. Seguire passo 3,4 nella sezione 3.
   Nota: Per rimanere all'interno di un arco di tempo di 30 minuti, si può ricominciare tutto lava durante l'allenamento a ~ 25 minuti.
4. Dopo l'ultimo lavaggio, rimuovere M9 surnatante tramite worm vuoto e trasferimento a testa di serie 60 piastre NGM mm.
   Nota: L'uso di piastre multiple per ogni genotipo non è necessario in questa fase in quanto il worm sono affamati.
5. Morire di fame su piastre da 60 mm NGM a temperatura ambiente per 30 minuti (Figura 1C).
6. Lavare worm con M9 tampone nel tubo da 15 ml. Lasciate che i vermi risolvere per gravità (NON centrifuga).
   Nota: Anche se non ci dovrebbero essere i batteri nel buffer, a questo punto, centrifugazione può essere un trattamento potenzialmente dannoso dei vermi, e può disturbare a lungo termine formazione della memoria.
7. Ripetere i passaggi 4,1-4,6 diverse volte fino a un totale di 7 blocchi di condizionamento e 6 blocchi di morire di fame sono stati completati (Figura 1C). (Vedi Tabella 1 per un foglio di tempo rappresentativo.)
8. Lavare delicatamente i vermi piatti fuori nel tubo da 15 ml conici e di nuovo 1-2X con tampone M9.
9. Dopo l'ultimo lavaggio, utilizzare una parte della popolazione vite senza fine per le prove chemiotassi (sezione 5) per verificare 7x (distanziati) apprendimento associativo del cibo-butanone associazione subito dopo il condizionamento (0 punto di ore). Apprendimento Index (LI) = _{0 ore} CI - CI _Naive.
10. Trasferire il restante popolazione di vermi piatti a mm 100 HGM seminato con 1 ml di OP50 (hold piastre). Anche in questo caso, applicare 100-200 ml di vermi per piastra al fine di evitare batteri abbastanza per sostenere la popolazione.
    Nota: il numero di piastre utilizzate per tenere genotipo è almeno il numero di lungo termine, i punti associativi tempo di memoria da testare. 100 piatti NGM mm può essere utilizzato anche come post-condizionamento piatti, ma bisogna stare molto attenti che ci sia abbastanza OP50 a sostegno della popolazione di vermi per almeno 16 ore.
11. Incubare post-condizionamento piastre per 16, 24, e 40 ore (a lungo termine della memoria associativa punti di tempo) a 20 ° C (Figura 1C).
    Nota: a lungo termine della memoria associativa di tipo selvaggio animali finisce per 40 ore dopo l'allenamento. Punti di tempo potrebbe essere necessario aggiustare di genotipi differenti o condizioni.
12. Per testare a lungo termine della memoria associativa del cibo-butanone associazione, lavare delicatamente worm via piastre in un tubo da 15 ml e di nuovo 1-2X con tampone M9 dopo ogni punto. Utilizzare i vermi per le prove chemiotassi (sezione 5). Apprendimento Index (LI) = CI _{punto Time} - CI _Naive.
    Nota: utilizzare i metodi di lavaggio delicato descritto nella Sezione 2. Per ogni punto di tempo, eliminare qualsiasi vermi extra non utilizzate nel test di chemiotassi.

5. Chemiotassi Assay

1. Preparare i piatti saggio chemiotassi. Segna il fondo di piatti millimetri testa di serie 100 NGM con macchie sul fondo e ogni lato della piastra (Figura 2A).
   Nota: almeno 3 repliche per genotipo deve essere eseguito per ottenere risultati statisticamente significativi.
2. Spot 1 ml di 1 M NaN ₃ alla odorizzante econtrolli in loco (Figura 2B).
   Nota: non macchia i tuoi piatti con questo agente paralizzante più di 15 minuti prima di iniziare il test, o il NaN ₃ sarà diffuso dal macchie, e gli animali saranno paralizzati prima di raggiungere l'odorizzante o punti di controllo. Fare attenzione a non forare il agar quando si applica NaN _{3, in} quanto vermi tana in aree forato.
3. Mentre i vermi stanno stabilendo nel tubo conico dopo diversi lavaggi tampone M9 (sezione 2), spot 1 ml ciascuna di EtOH 95% e il 10% butanone (vedi Sezione 7.2) nei punti appropriati sulla piastra test marcato (Figura 2C) sulla superiore del già macchiato NaN 3.
   Nota: Le sostanze chimiche devono essere individuati prima di aggiungere i vermi (Sezione 5.4). Prendere nota di cui spot ha EtOH o butanone. Quando si lavora con queste sostanze chimiche volatili, fare attenzione ad aprire solo i coperchi delle piastre in caso di necessità, e tenerle chiuse in tutti gli altri.
4. Rimuovere la maggior quantità del buffer M9 possibile dal tubo di vermi risolta. Utilizzare un P20 Pipetman con un pre-taglio punta (vedi Sezione 7.3) per fornire 3X 5 vermi microlitri (200-400 animali) l'origine del piatto dosaggio marcato (Figura 2D).
   Nota: tenere i vermi rimanenti nel tubo da 15 ml conica per l'impiego in pre-condizionamento fame e test di memoria (sezioni 2-4). Worm che si attacchi all'interno puntali, quindi l'aggiunta vermi alla piastra in quantità minori conserva la popolazione verme e riduce la quantità di liquido che viene rilasciato con i vermi nel piatto test.
5. Torsione l'angolo di un KimWipe ad un punto piccolo e utilizzarlo per cancellare il buffer in eccesso M9. Ciò libererà i vermi sulla piastra di test (Figura 2E).
   Nota: Fare attenzione a non forare l'agar con il KimWipe, altrimenti vermi tana all'origine. Alcuni worm possono essere persi in questa fase in quanto sono tirato in KimWipe con il buffer M9 quando assorbente. Se si utilizza l'imaging e analisi di contare i vermi (sezione 6), prendere le piastre per la stazione di imaging prima di rilasciare vermi dall'origine. Un'immagine dei worm all'origine subito dopo il rilascio darà il numero totale di animali per un piatto di test.
6. Incubare la piastra test chemiotassi per 1 ora a temperatura ambiente.
7. Contare il numero di worm all'origine, EtOH, e macchie butanone (Figura 2), così come il numero totale di vermi nel piatto saggio.
   Nota: In genere, worm paralizzato da NaN ₃ sarà entro un raggio di 1 cm ~ delle macchie, e apparirà bastone-retta con molti animali accatastati gli uni contro gli altri. Se si utilizza l'imaging e software di analisi di contare i vermi (sezione 6), prendere le immagini della provenienza, EtOH, e macchie butanone. Un'immagine della quantità totale di worm avrebbe dovuto essere presa nella sezione 5.5. Worm possono essere anche "a mano contato."
8. Calcolare l '"Indice chemiotassi" (CI). CI = ([(n _Butanone) - (n _EtOH )]/[( Totale-n _Origin)].

6. Worm conteggio di Image Analysis

1. Prendete ad alto contrasto nero-bianco e le immagini di vermi su lastre test chemiotassi (Figura 3A, vedi Sezione 7.4 per la descrizione di installazione della telecamera). Per calcolare un indice di chemiotassi, le immagini sono necessari al butanone, EtOH, e macchie origine di un piatto di dosaggio chemiotassi al termine di un test, così come il numero totale di vermi (foto di vermi all'origine subito dopo che sono stati rilasciati dal tampone M9 all'inizio del test, Sezione 5.5).
   Nota: le immagini delle lastre saggio chemiotassi che copre circa un raggio di 2 cm intorno ogni spot in genere catturare tutti gli animali per ogni spot.
2. Assicurarsi che i file per tutte le prove di un punto temporale (ad esempio Naive, 0 ore, ecc) sono contenute in una cartella, denominata in modo appropriato.
3. File per ogni piastra chemiotassi devono essere chiamati come tali: ma # png (spot butanone, prova #), Ori # png (origine, prova #), eth # png (spot etanolo, prova #), tot # png.... (totale, prova #). (Per esempio, se due studi sono stati eseguiti per un punto del tempo, nella stessa cartella i seguenti file sarebbe stato presente: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . png, tot2.png)
4. Aperto Matlab (vedi Sezione 7.5).
5. Nella "Current Directory" linea nella parte alta della finestra di Matlab, navigare per le cartelle, e scegliere la cartella "count_worms_v0.5.3" (M-files disponibili come informazioni supplementari).
6. Nella "Finestra di comando", "count_worms_directory ()." Tipo Premete Invio.
   Nota: La dimensione predefinita quando verme per questo comando è min 10, max 80 pixel. Per regolare questo sulla base di un genotipo specifico o stadio di sviluppo, digitare "count_worms_directory ('minsize', 10 'dimensione_max', 80)" e modificare i numeri di pixel di conseguenza.
7. Quando richiesto, scegliere la cartella di immagini da analizzare.
   Nota: solo una cartella di immagini possono essere analizzati in un momento.
8. Ogni immagine nella cartella da analizzare si aprirà con una soglia già impostato, e le particelle selezionate (Figura 3A). Trascinare lo strumento rettangolo sopra particelle selezionate che non sono i vermi eliminare °em. Una volta terminato con l'immagine, premere il tasto Esc.
9. Dopo tutte le immagini nella cartella vengono controllati, 4 colonne apparirà nella finestra di comando: (1) nome dell'immagine (esempio but1), (2) sempre "[1];" (3) dimensione del pixel media per un verme calcolato dal programma l'immagine particolare; e (4) il numero di worm calcolato essere nell'immagine.
10. Una volta che questo programma ha eseguito, depositerà due. File csv (possono essere letti come fogli di calcolo Excel) nella cartella di immagini che ha appena analizzati. Il file "worm_counts_stats" fornisce le colonne di output trovato nella finestra di comando (Sezione 6.9). Il file "worm_counts_summary" prevede 5 colonne: (1) numero di prova, il numero di worm in (2), ma, (3) eth, e (4) punti ori, e (5) numero totale di vermi.

7. Materiali Note

1. Per preparare 100 millimetri multimediali ad alta crescita (HGM) piastre (sezione 1): Sciogliere 3 g di NaCl, 20 g Bactopeptone, e 30 g Bacto-agar in 700 ml di acqua distillata. Portare il volume a 1 L con acqua distillata. Dopo la sterilizzazione in autoclave, agar fresco per 65oC e aggiungere 4 ml di 5 mg / ml colesterolo in etanolo, 1 ml ciascuno di 1 M CaCl _2, 1 M MgSO _4, e 25 ml di 1 M KPO ₄ (pH = 6.0).
2. EtOH 95% viene utilizzato, come EtOH percentuale tende a contenere impurità dal processo di purificazione che può influenzare i risultati. E 'una buona idea per rendere il butanone 10% (nel 95% EtOH) scorta di fresco ogni paio di volte che si esegue il test.
3. P20 punte deve avere qualche millimetro tagliato per creare un buco abbastanza grande per i vermi a passare attraverso senza subire danni. P1000 suggerimenti già hanno dei fori abbastanza grande per i vermi a passare attraverso.
4. Il saggio di chemiotassi piastra di imaging stazione (Figura 3B) in laboratorio Murphy contiene una telecamera Firewire con una lente di ingrandimento variabile collegato a una posizione del braccio. La retroilluminazione è posizionato sul fondo dello stand sotto una piattaforma di imaging personalizzata con piano in vetro (Figura 3C), che consente piatti saggio chemiotassi di essere illuminato dal basso. Il software "Misura e Automazione" (National Instruments) viene utilizzato per catturare le immagini. Materiali per questa stazione di imaging costituiti sono simili a quelli precedentemente pubblicato, il ¹² e può essere trovato nella tabella di reagenti e attrezzature specifiche.

8. Rappresentante dei risultati:

Un tipico indice chemiotassi naïve (CI) per la wild-type worm per il 10% butanone è di circa 0,2 (Figura 4A). Ammassati ⁶ (1x) o distanziati (7x) formazione generalmente aumenta l'indice di chemiotassi di 0,7-0,8 al tempo 0 (Figura 4A, CD) per dare un indice di apprendimento (LI = addestrati CI -. ingenui CI) di ~ 0.6 ⁶ L'apprendimento che si verifica con la formazione ammassati o distanziati è molto robusto. Un LI inferiore a 0,5 si presenta in genere quando ci sono problemi con il saggio chemiotassi ingenui, e gli animali hanno un CI ingenuo di 0,3 o superiore. Di solito, questo si verifica perché i vermi muoiono di fame o troppo affollate sulle piastre di coltivazione tra lo sbiancamento e l'inizio del test, o vermi seduti troppo a lungo in un tampone di M9 tra un lavaggio e cominciano a morire di fame; odori ambientali possono anche aumentare gli ingenui CI. I vermi hanno una fame molto più alto CI ingenuo per il 10% butanone (Figura 4B). ⁶ Troviamo che i problemi con la chemiotassi ingenuo sono generalmente risolte con cura verme migliorata e coltura.

La durata della memoria in questi test è il tempo necessario per l'indice chemiotassi immediatamente dopo l'allenamento per tornare ai livelli ingenuo, quando l'indice di apprendimento = 0. In wild-type animali, memoria a breve termine associativa inizia in genere a diminuire di 1 ora dopo l'allenamento ammassati, dura circa 2 ore, ed è indipendente dal fattore di trascrizione CREB (Figura 4C). ⁶ a lungo termine della memoria associativa in genere non si avvia di rifiutare in modo significativo fino a 16 ore dopo l'allenamento distanziati, dura fino a 40 ore, ed è CREB-dipendente (Figura 4D) ⁶ a lungo termine della memoria associativa non può raggiungere il suo pieno potenziale in diversi casi: (1). vermi non hanno abbastanza OP50 E. coli durante i 30 minuti in periodi di condizionamento, (2) batteri rimangono nel buffer M9 durante i periodi di carestia, o (3) vermi sono danneggiati durante il test (ad esempio i worm sono pipettati contro la parete del tubo).

I risultati sono generalmente statisticamente significative quando 4 o più prove di analisi chemiotassi sono gestiti per genotipo per ogni punto del tempo. Esecuzione di sei repliche per genotipo produce generalmente risultati molto significativi, senza diventare troppo da gestire, ma i principianti può essere utile iniziare con solo tre repliche. In generale, lavorando con 2-3 genotipi o le condizioni in un momento è comodo per coloro che hanno esperienza con questi test di apprendimento e memoria.

Mano per contare i vermi su piatti saggio chemiotassi richiede molto tempo, può aggiungere variabilità tra esperimenti o compagni di laboratorio, e può anche introdurre distorsioni quando le analisi e honterpreting dati. Worm conteggio di analisi d'immagine (sezione 6) standardizza la raccolta el'analisi dei dati attraverso il laboratorio, e in media, i tagli di analisi dati in tempo per i membri di laboratorio con esperienza di 1 / 5 di quella necessaria per il conteggio a mano. Quando si confrontano gli indici chemiotassi calcolato utilizzando conta verme manuale a quelli determinati dal software Count_worms, troviamo un errore medio di 3,07 (± 1,19)%.

Giorno 1
Tempo	Passo
09:00	1 ora muoiono di fame in M9 tampone Inizio ingenuo saggio chemiotassi
10:00	Condizione # 1 (60 millimetri piastre NGM con il cibo e butanone), 30 min Ingenuo saggio finale chemiotassi
10:30	Morire di fame # 1 (60 mm piastre NGM), 30 min
11:00	Condizione # 2, 30 min
11:30	Morire di fame # 2, 30 min
12:00	Condizione # 3, 30 min
12:30	Morire di fame # 3, 30 min
01:00	Condizione # 4, 30 min
01:30	Morire di fame # 4, 30 min
02:00	Condizione # 5, 30 min
02:30	Morire di fame # 5, 30 min
03:00	Condizione # 6, 30 min
03:30	Morire di fame # 6, 30 min
04:00	Condizione # 7, 30 min
04:30	Iniziare 0-h chemiotassi test Trasferimento worm rimanenti per tenere i dischi per 16-40 ore
05:30	Fine 0-h chemiotassi test
2 ° giorno
Tempo	Passo
08:30	Iniziare a 16 ore chemiotassi test
09:30	Fine 16-ore chemiotassi test

Tabella 1. Rappresentante programma a lungo termine, test di memoria associativa. In questo esempio, il saggio inizia il 1 ° giorno alle ore 9 con un 1-hr di fame. 30 min condizione e si alternano periodi di morire di fame fino a quando i vermi sono stati condizionati sette volte. Saggi di chemiotassi vengono eseguiti all'inizio (ingenuo) e fine (0 ore) di formazione. Il totale di run-time, dall'inizio alla fine è di 8,5 ore. Worms su piastre attesa vengono testati per chemiotassi a butanone a partire dal giorno 2, 16-40 ore dopo l'allenamento.

Figura 1. Breve e lungo termine del flusso di lavoro associativo test di memoria. (A) timeline consigliati di preparazione che portano al test giorno sono eseguite. (B) a breve termine del test di memoria associativa: vermi Starved sono condizionati per 1 ora e testati immediatamente per l'apprendimento 1x (0 min.) Attraverso saggi chemiotassi, o trasferite su piastre ad accumulo con il cibo per 0,5, 1, o 2 ore dopo il condizionamento. (C) a lungo termine del test di memoria associativa: animali Starved ricevere 7 isolati formazione di condizionamento / morendo di fame prima di essere testati per l'apprendimento o LTAM 16-40 ore dopo l'allenamento.

Figura 2. Impostazione saggio chemiotassi. (A) Schema di piatto saggio chemiotassi. Piccoli punti vengono aggiunti al piatto con l'aiuto di un righello o altro dispositivo di guida a indicare l'origine (in basso) e butanone e EtOH (sinistra e destra) punti sul piatto. (B) 1 ml NaN ₃ è aggiunto ai luoghi butanone e EtOH. (C) 1 ml ciascuno del 10% butanone e il 95% EtOH sono aggiunti i punti sul lato sinistro o destro della piastra. (D) 200-400 vermi sospese in M9 tampone vengono aggiunti l'origine del piatto. (E) A KimWipe intrecciati in un punto è utilizzato per assorbire tampone M9 e worm rilasciare sul piatto di test.

Figura 3. Worm conteggio con l'analisi delle immagini. (A) Esempio di finestra di selezione "count_worms_v0.5.3" particella di immagine. Il programma apre immagine originale ad alto contrasto bianco e nero (a sinistra) si apre automaticamente una finestra con una immagine thresholded (al centro). Lo strumento rettangolo può essere utilizzato per evidenziare ed eliminare indesiderato non verme "particelle", come i segni di piastra saggio (1), bordi piastra (2), o forature agar (3). (B) Immagine della stazione di Murphy di imaging laboratorio analisi chemiotassi. Piastre di test chemiotassi sono illuminati dal basso per creare immagini ad alto contrasto necessari per l'analisi. (C) Schema di misurapiattaforma di imaging utilizzata nella stazione di imaging chemiotassi.

Figura 4. Tipiche apprendimento associativo e dei risultati di memoria. (A) gli ingenui indice chemiotassi di wild-type worm butanone ad aumenti del 10% su ammassati (1x) di formazione. L'associazione è appreso richiede l'abbinamento di cibo (OP50 E. coli) e butanone. Numeri sopra le barre rappresentano l '"Indice di apprendimento" (LI = CITrained - CI _Naive). (B) Selvaggio chemiotassi ingenuo tipo al 10% butanone è notevolmente aumentata quando i vermi sono a digiuno per 16 ore. DC I pannelli sono adattate da Kauffman et al., 2010. ⁶ (C) Wild tipo memoria a breve termine associativa dura circa 2 ore, ed è indipendente dal fattore di trascrizione CREB. (D) Selvaggio tipo memoria a lungo termine associativa dura circa 40 ore, ed è CREB-dipendente.

Informazioni supplementari

• Clicca qui per il file "imoverlay.m" .
• Clicca qui per il file "count_worms_image.m" .
• Clicca qui per il file "count_worms_directory.m" .
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Discussion

Il C. elegans olfattivo apprendimento associativo e test di memoria presentata qui distinguere tra i processi di apprendimento ammassati, distanziati di apprendimento, memoria a breve termine e memoria a lungo termine. Questi test si basano sulle capacità del worm 'di percepire gli odori alimentari e chimiche nel loro ambiente e ^1,2 per formare associazioni positive tra le due. ⁶ Perciò, i test sono molto sensibili alla fame la popolazione di partenza degli animali, e grande attenzione deve da adottare per garantire che i vermi sono ben nutriti, prima e dopo l'allenamento. Singola formazione ammassati i rendimenti a breve termine memoria associativa. L'aumento del numero di periodi di condizionamento e paradigma di formazione distanziati è fondamentale per il raggiungimento a lungo termine memoria associativa in C. elegans come in altri organismi. ^6,8 Forse questo test potrebbe essere modificato per produrre memoria a lungo termine di associazioni tra diversi stimoli condizionati e incondizionati.

Il nostro apprendimento associativo e test di memoria può essere utilizzata per confrontare le capacità di apprendimento e la memoria di tipo selvatico di animali mutanti invecchiamento o genetiche. Per esempio, mentre sia l'apprendimento associativo e di lungo periodo associativo declino della memoria abilità nel processo di invecchiamento wild-type worm, l'apprendimento è mantenuto più a lungo con l'età negli animali con segnalazione dell'insulina ridotta, e l'apprendimento e la memoria è mantenuta più a lungo con l'età negli animali restrizione calorica ^6. Questi test sono anche suscettibili di RNAi trattamento o la manipolazione farmacologica di C. elegans. Per esempio, il trattamento di vermi con daf-2 RNAi migliora a breve e lungo termine della memoria associativa, per converso, il blocco della trascrizione genica e sintesi proteica con farmaci (actinomicina D e cicloeximide, rispettivamente) durante l'allenamento distanziati interrompe a lungo termine formazione della memoria. ⁶

Memoria a lungo termine è un processo che è cruciale per la sopravvivenza in tutti gli animali, e sembra che gran parte delle macchine molecolari coinvolti nella memoria di una associazione pavloviana è conservata da vermi ai mammiferi. ⁶ La capacità di distinguere e test di apprendimento associativo, breve termine e memoria a lungo termine con questi test olfattivi rende C. elegans un eccellente sistema per lo studio ulteriore della memoria, e può fornire una conoscenza dei processi neurodegenerativi che portano alla perdita di apprendimento e memoria negli esseri umani.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Azide		Fisher Scientific	S227	Prepare 1 M concentration in distilled water
Ethyl Alcohol 190 Proof		Pharmco-Aaper	DSP-CT-18	>95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays
2-Butanone 99+%		Acros	14967-0010
Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera		Edmund Optics	NT56-683
InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial		Edmund Optics	NT56-202
Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator		Edmund Optics	NT55-718
8” x 8” Backlight		Schott Fostec	A08927
Standard Boom Stand		Edmund Optics	NT54-120
3/4” Post Adaptor for Boom Stands		Edmund Optics	NT54-124
Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate		Edmund Optics	NT54-122