Элеганс C. Положительные обучения бутанон, краткосрочный и долгосрочный Ассоциативные Анализы памяти

Summary

Здесь мы опишем методы тестирования C. Элеганс ассоциативного обучения и краткосрочных и долгосрочных ассоциативной памяти. Эти анализы населения используют червей способности к chemotax летучих пахучих веществ, а также форма положительных ассоциаций на спаривание пищу с хемоаттрактант бутанон. Увеличение количества кондиционирования периоды вызывает долговременной памяти.

Abstract

The memory of experiences and learned information is critical for organisms to make choices that aid their survival. C. elegans navigates its environment through neuron-specific detection of food and chemical odors^{1, 2}, and can associate nutritive states with chemical odors³, temperature⁴, and the pathogenicity of a food source⁵.

Here, we describe assays of C. elegans associative learning and short- and long-term associative memory. We modified an aversive olfactory learning paradigm⁶ to instead produce a positive response; the assay involves starving ~400 worms, then feeding the worms in the presence of the AWC neuron-sensed volatile chemoattractant butanone at a concentration that elicits a low chemotactic index (similar to Toroyama et al.⁷). A standard population chemotaxis assay1 tests the worms' attraction to the odorant immediately or minutes to hours after conditioning.

After conditioning, wild-type animals' chemotaxis to butanone increases ~0.6 Chemotaxis Index units, its "Learning Index". Associative learning is dependent on the presence of both food and butanone during training. Pairing food and butanone for a single conditioning period ("massed training") produces short-term associative memory that lasts ~2 hours. Multiple conditioning periods with rest periods between ("spaced training") yields long-term associative memory (<40 hours), and is dependent on the cAMP Response Element Binding protein (CREB),⁶ a transcription factor required for long-term memory across species.⁸

Our protocol also includes image analysis methods for quick and accurate determination of chemotaxis indices. High-contrast images of animals on chemotaxis assay plates are captured and analyzed by worm counting software in MatLab. The software corrects for uneven background using a morphological tophat transformation.⁹ Otsu's method is then used to determine a threshold to separate worms from the background.¹⁰ Very small particles are removed automatically and larger non-worm regions (plate edges or agar punches) are removed by manual selection. The software then estimates the size of single worm by ignoring regions that are above a specified maximum size and taking the median size of the remaining regions. The number of worms is then estimated by dividing the total area identified as occupied by worms by the estimated size of a single worm.

We have found that learning and short- and long-term memory can be distinguished, and that these processes share similar key molecules with higher organisms.^6,8 Our assays can quickly test novel candidate genes or molecules that affect learning and short- or long-term memory in C. elegans that are relevant across species.

Protocol

Эти C. Элеганс ассоциативного обучения и памяти анализы требуют предварительной подготовки. Для предложили график подготовки, см. сроки представлены на рисунке 1А. Также отметим, что воспоминания червей может быть нарушена физическая агитация (грубая пипетки, центрифугирование, вортексе), и что наивный хемотаксис можно возмущенного чрезмерным запахи (духи, и т.д.) в окружающую среду.

1. Подготовка животных в Пробирной

1. Развивайте червей на 100 мм питательной среды (HGM) пластин (см. раздел 7.1 для рецепта) посеян с 1 мл OP50 Е. палочка с использованием стандартных методов. ¹¹
2. Гипохлорит лечению по крайней мере два густонаселенных пластин HGM из беременных взрослых червей для получения больших синхронизированных населения яиц.
   Примечание: Для получения наилучших урожаев, хлорная известь первого поколения для получения высоко синхронизирован населения, то отбеливатель второго поколения, как День 2 взрослых получить яйца для следующего шага.
3. Равномерно разделить яйца на 3-4 пластин HGM посеян с 1 мл OP50 Е. палочки для каждого гипохлорита рассматриваются пластины.
   Примечание: Важно, чтобы черви выращиваются с большим количеством свежих продуктов, как голод может повлиять на результат обонятельных анализов.
4. Инкубируйте червей при 20 ° С в течение приблизительно 72 часов, время, которое требуется для животных достигают стадии молодых взрослых.

2. Предварительное кондиционирование Голодать

1. Тщательно проверьте настройки HGM пластин с молодых людей, чтобы убедиться, черви все еще есть много пищи, и что Существуют достаточно червей для анализа (≥ 200 червей на анализ пластины).
2. Вымойте червей прочь HGM пластин с M9 буфера ¹¹ в 15 мл коническую трубку. Для наименее агитации во время мойки, мягко применять буфер М9, поливая несколько миллилитров на тарелку HGM и осторожно вращать пластину, чтобы освободить от червей липкой OP50 бактерий. Далее, наклона пластины, подтяните M9 буфер / червь смесь из угла пластины с использованием P1000 pipetman и передачи червей 15 мл коническую трубку. Если черви, не осталось на тарелке, повторите этот шаг 1-2х.
   Примечание: Rough стиральной смещает бактерии прочь пластин, которые могут превратить его в трубку с червями. Это бактерии невозможно избавиться, и может повлиять на анализы. НЕ пипетки червей против стороны трубки, так как это может повредить червей и вмешиваться в анализах.
3. Давайте червей урегулировать под действием силы тяжести (НЕ центрифуги). Удалить супернатант вакуума и промыть не менее 3-4 мл M9. Повторите 2 раза в общей сложности 3 стирок.
   Примечание: во время Центрифугирование моет будет тянуть вниз все оставшиеся бактерии в червь населения, которое может повлиять на анализы. Вместо этого, аккуратно добавить M9 буфер для последующего моет, поливая его непосредственно в 15 мл коническую трубку. Черви поселились в нижней части трубки должны стать смешиваются в буфер М9 на его дополнение. Если черви оставались урегулирован, аккуратно переверните трубку перемешать.
4. После третьей стирки, использовать некоторые из червей населения для наивных анализов хемотаксиса (раздел 5).
   Примечание: Очень важно работать достаточно быстро на всех промывания, как черви начнут голодать, если они сидят слишком долго в M9 буфера, что может повысить наивные хемотаксис к бутанон.
5. Добавить 3-4 мл M9 буфера в 15 мл коническую трубку, не говоря черви голодать в буфер М9 при комнатной температуре в течение 1 часа (рис. 1В, С).

3. Краткосрочные ассоциативной памяти (массированные) обучение

См. рисунок 1B для краткосрочного ассоциативный анализ рабочих процессов памяти.

1. В конце голодать период M9 буфер (раздел 2), полоса 2 мкл 10% бутанон (в 95% этанола) на внутренней стороне крышки 60 мм нематоды питательной среды (НГО) ¹¹ пластин, которые были посеяны с 500 мкл OP50 Е. палочки.
   Примечание: Хорошая отправная населения для краткосрочных и долгосрочных анализов памяти ≥ 500 мкл червей. Несколько пластин кондиционирования необходимы в генотипе для поддержки всего населения во время тренировки. При работе с летучими химическими веществами, только открытые крышки пластин при необходимости, оставляя их закрытыми во все другие времена.
2. Удалить супернатант M9 буфер из 15 мл коническую трубку голодали червей вакуумной и использовать P1000 pipetman применять 100-200 мкл червей кондиционирования пластин.
   Примечание: Попробуйте удалить как можно больше жидкости M9 это возможно, так что черви могут быстро добраться до OP50 источником питания при передаче на кондиционирование пластин. Черви будет придерживаться внутри кончика пипетки и может быть сохранена с помощью пипетки меньших объемах.
3. Инкубируйте кондиционирования пластин при комнатной температуре в течение 1 часа (рис. 1В).
4. Вымойте червей от пластин с ~ 1 мл M9 буфера в 15 мл коническую трубку. Давайте червей урегулировать под действием силы тяжести. Вымойте снова 1-2х до M9 буфера в трубке ясно.
   Примечание: Использование мягкого мытья методы, описанные в разделе2. Же 15 мл коническую трубку можно использовать из раздела 2.
5. После последней промывки, удалить супернатант M9 буфер вакуум, и использовать некоторые из червей населения за хемотаксис анализы (раздел 5), чтобы проверить на 1x (массированные) ассоциативного обучения пищевой бутанон ассоциации сразу после выдерживания (0 минута момент времени ).
   Обучение Index (LI) = CI _{0 ч} - CI _{Наивные.}
6. Передача оставшейся популяции червей до 60 мм пластин NGM засеяно 500 мкл OP50 (удерживая пластины). Опять же, применять 100-200 мкл червей на пластине для обеспечения Есть достаточно бактерий для поддержки населения.
   Примечание: Число держать пластины, используемые в генотипе, по крайней мере число краткосрочных ассоциативной памяти моменты времени для тестирования.
7. Инкубируйте после кондиционирования пластин для 0,5, 1 или 2 часа (краткосрочные ассоциативные моменты времени памяти) при комнатной температуре (рис. 1В).
   Примечание: Краткосрочные ассоциативная память о животных дикого типа заканчивается 2 часа после тренировки. Время точек может нуждаться в корректировке для различных генотипов или условий.
8. Для тестирования для краткосрочного ассоциативной памяти пищевой бутанон ассоциации, после каждой временной точке, осторожно мыть червей от тарелки в 15 мл коническую трубку и снова 1-2X буфером M9. Использование червей для хемотаксиса анализы (раздел 5). Обучение Index (LI) = CI _{Время точка} - CI _{Наивные.}
   Примечание: используйте нежный методы стиральной описано в разделе 2. Для каждого момента времени, отказаться от каких-либо дополнительных червей, которые не используются в хемотаксис анализов.

4. Долгосрочные ассоциативной памяти (интервал) Обучение

См. рисунок 1С для долгосрочного анализа рабочего процесса ассоциативной памяти.

1. Выполните шаги 3.1-3.2 в разделе 3.
2. Инкубируйте кондиционирования пластин при комнатной температуре в течение 30 минут (рис. 1в).
3. Выполните шаг 3.4 в разделе 3.
   Примечание: Чтобы оставаться внутри 30-минутный срок, можно начать все моет за время обучения в ~ 25 минут.
4. После последней промывки, удаления M9 супернатант вакуума и передачи червей unseeded 60 пластин мм NGM.
   Примечание: использование нескольких пластин в генотипе не требуется на данном этапе с червями морят голодом.
5. Голодать на 60 мм пластин NGM при комнатной температуре в течение 30 минут (рис. 1в).
6. Вымойте черви с M9 буфера в 15 мл коническую трубку. Давайте червей урегулировать под действием силы тяжести (НЕ центрифуги).
   Примечание: В то время не должно быть никаких бактерий в буфере на данный момент, центрифугирование могут быть потенциально опасными лечения червями, и может нарушить долгосрочные формирование памяти.
7. Повторите шаги 4.1-4.6 несколько раз, пока в общей сложности 7 блоков кондиционирования и 6 голодать блоки были завершены (рис. 1в). (См. Таблицу 1 для табеля рабочего времени представителя.)
8. Осторожно промыть червей от тарелки в 15 мл коническую трубку и снова 1-2X буфером M9.
9. После последней промывки, использовать некоторые из червей населения для анализов хемотаксис (раздел 5), чтобы проверить на 7x (интервал) ассоциативного обучения пищевой бутанон ассоциации сразу после выдерживания (0 час момент времени). Обучение Index (LI) = CI _{0 ч} - CI _{Наивные.}
10. Передача оставшейся популяции червей до 100 мм пластин HGM засеяно 1 мл OP50 (удерживая пластины). Опять же, применять 100-200 мкл червей на пластине для обеспечения Есть достаточно бактерий для поддержки населения.
    Примечание: Число держать пластины, используемые в генотипе по крайней мере, число долгосрочных ассоциативной памяти моменты времени для тестирования. 100 мм пластин NGM также может быть использован как пост-кондиционирования плиты, но надо быть очень осторожным, что есть достаточно OP50 для поддержки населения червей, по крайней мере 16 часов.
11. Инкубируйте после кондиционирования пластины для 16, 24, и 40 часов (долгосрочные ассоциативные моменты времени памяти) при 20 ° С (рис. 1в).
    Примечание: Долгосрочный ассоциативная память о животных дикого типа заканчивается 40 часов после тренировки. Время точек может нуждаться в корректировке для различных генотипов или условий.
12. Для проверки для долгосрочных ассоциативной памяти пищевой бутанон ассоциации, мягко мыть червей от тарелки в 15 мл коническую трубку и снова 1-2X буфером M9 после каждого момента времени. Использование червей для хемотаксиса анализы (раздел 5). Обучение Index (LI) = CI _{Время точка} - CI _{Наивные.}
    Примечание: используйте нежный методы стиральной описано в разделе 2. Для каждого момента времени, отказаться от каких-либо дополнительных черви не используется в хемотаксис анализов.

5. Хемотаксис Пробирной

1. Подготовка хемотаксис пластины теста. Марк нижней части unseeded 100 мм пластин NGM с пятнами на дне, и каждой стороне пластины (рис. 2А).
   Примечание: По крайней мере, 3 повторяет в генотип должен быть запущен для получения статистически значимых результатов.
2. Spot 1 мкл 1 М NaN ₃ на одоранта иконтроль местная (рис. 2В).
   Примечание: Не место вашей плиты с этой парализующий агент более чем на 15 минут до начала теста, или NaN ₃ будет диффундировать от пятен, и животных окажется парализованным до достижения одоранта или контроля пятна. Будьте осторожны, чтобы не проколоть агар при применении NaN _3, так как черви норы в проколотой областях.
3. В то время как черви поселились в конической трубе после нескольких буферов моет M9 (раздел 2), пятно 1 мкл каждого из 95% этанола и 10% бутанон (см. раздел 7.2) при соответствующих пятен на пластине помечены анализа (рис. 2С) на верхней части ранее пятнистый NaN 3.
   Примечание: химических веществ должны быть выставлены перед добавлением червей (раздел 5.4). Запишите которых пятно этанола или бутанон. При работе с этими летучих химических веществ, будьте осторожны, чтобы только открыть крышку пластин, когда это необходимо, и держать их закрытыми во все другие времена.
4. Удалить столько буфером M9 как можно дальше от трубки поселились черви. Используйте P20 pipetman с нарезанные наконечник (см. раздел 7.3) для доставки 3X 5 мкл червей (200-400 особей) о происхождении отмечен пластины анализа (рис. 2D).
   Примечание: Следует оставшихся червей в 15 мл коническую трубку для использования в Предварительное кондиционирование голодать и памяти анализов (разделы 2-4). Черви будут придерживаться советов внутри пипетки, так что добавление червей к пластине в меньших количествах сохраняет ваш червь населения и уменьшает количество жидкости, которое получает выпущен с червями на анализе пластины.
5. Твист углу KimWipe в маленькую точку и использовать его, чтобы уничтожить до избыточного буфером M9. Это высвободит червей на анализ пластины (рис. 2Е).
   Примечание: Будьте осторожны, чтобы не проколоть агар с KimWipe, иначе черви норы в начале координат. Некоторые черви могут быть потеряны в этом шаге, поскольку они потянули в KimWipe с буфером M9, когда блоттинга. При использовании изображений и анализа рассчитывать черви (раздел 6), возьмите пластин для визуализации станции перед выпуском червей от начала координат. Образ червей в начале сразу после освобождения даст общее количество животных для анализа пластины.
6. Инкубируйте планшет хемотаксис анализа в течение 1 часа при комнатной температуре.
7. Подсчитайте количество червей на происхождение, этанола и бутанон пятна (рис. 2), а также общее количество червей на анализ пластины.
   Примечание: Как правило, черви парализованы NaN ₃ будет в пределах 1 см радиус пятна, и появятся палки прямо со многими животными укладываются друг на друга. При использовании изображений и анализа программного обеспечения для подсчета черви (раздел 6), получать изображения происхождения, этанола и бутанон пятна. Образ общую сумму черви должны были быть приняты в разделе 5.5. Черви могут быть также "ручной рассчитывали".
8. Вычислить "Хемотаксис Index" (ДИ). CI = ([(п _{бутанон)} - (п _EtOH )]/[( Всего-н _{происхождения)].}

6. Worm Подсчет по анализу изображений

1. Возьмите высокую контрастность черно-белого изображения червей на хемотаксис анализа пластин (рис. 3А, см. раздел 7.4 для описания настройки камеры). Для расчета индекса хемотаксис, изображения необходимы на бутанон, этанола и происхождения пятна пластины анализа хемотаксис в конце анализа, а также общее количество червей (картина червей на происхождение сразу же после их выхода из M9 буфера в начале теста, раздел 5.5).
   Примечание: Изображения хемотаксис пластин анализа общей площадью около 2 см в радиусе вокруг каждого пятна обычно захватить все животные для каждого пятна.
2. Убедитесь, что файлы для всех испытаний одной временной точке (пример наивного, 0 часов, и т.д.) содержатся в одной папке, названной соответственно.
3. Файлы для каждой пластины хемотаксис должен быть назван следующим образом: а # PNG (бутанон месте, суд #), # ори PNG (происхождение, проба #), ETH # PNG (этанол месте, суд #), малыш # PNG.... (всего, судебный процесс #). (Например, если два испытания были проведены на момент времени, в той же папке следующие файлы будут присутствовать: but1.png, but2.png, eth1.png, eth2.png, ori1.png, ori2.png, tot1 . PNG, tot2.png)
4. Открытое Matlab (см. раздел 7.5).
5. В "Текущий каталог" строки в верхней части окна Matlab, найдите папку, и выберите "count_worms_v0.5.3" папку (M-файлы, доступные в качестве дополнительной информации).
6. В "Окно команд", типа "count_worms_directory ()". Жмем Enter.
   Примечание: по умолчанию размер червя, когда для этой команды мин 10, макс 80 пикселей. Чтобы изменить это на основе конкретных генотип или стадии развития, типа "count_worms_directory ('мин_разм', 10 'MAXSIZE', 80)" и изменения пикселей номеров соответственно.
7. В ответ на запрос, выберите папку с изображениями, которые будут проанализированы.
   Примечание: Только одна папка изображений можно анализировать одновременно.
8. Каждый образ в папку анализируемых появится с порога уже установлен, и частицы выбран (рис. 3А). Перетащите инструмент прямоугольник над выбранной частицы, которые не являются червями удалить йет. Когда закончите с изображения, нажмите клавишу Esc.
9. После всех изображений в папке проверяются, 4 колонки появятся в окне командной строки: (1) имя образа (например but1); (2) всегда "[1];" (3) средний размер пикселя для одного червя рассчитывается путем Программа конкретного изображения, а также (4) количество червей рассчитывается как на изображении.
10. Как только эта программа закончилась, он будет размещать два. CSV-файлов (может быть открыт как Excel таблицы) в папку с изображениями он только что проанализировали. "Worm_counts_stats" файл содержит выходные столбцы найти в окне команд (см. раздел 6.9). "Worm_counts_summary" файл содержит 5 столбцов: (1) тройственное число, количество червей в (2), но, (3) ETH, и (4) ориентация пятна, и (5) общее количество червей.

7. Материалы Notes

1. Для подготовки высотой 100 мм питательной среды (HGM) пластин (раздел 1): Растворить 3 г NaCl, 20 г Bactopeptone, и 30 г Бакто-агара в 700 мл дистиллированной воды. Довести объем до 1 л дистиллированной водой. После автоклавирования, прохладном агар для 65oC и добавляют 4 мл 5 мг / мл холестерина в этаноле, 1 мл каждая из 1 М CaCl _2, 1 М MgSO ₄ и 25 мл 1 М КПО ₄ (рН = 6,0).
2. 95% этанола используется, как более высокий процент этанола как правило, содержат примеси из процесса очистки, которые могут повлиять на результаты. Это хорошая идея, чтобы 10% бутанон (в 95% этанола) запастись свежими в несколько раз анализ выполняется.
3. P20 советы должны иметь несколько миллиметров отрезать, чтобы создать отверстие достаточно большой для червей, чтобы соответствовать через без повреждений. P1000 советы уже есть дыры, достаточно большой для червей, чтобы соответствовать через.
4. Анализ хемотаксис пластине изображений станции (рис. 3Б) в лаборатории Мерфи содержит Firewire камера с переменным увеличением линзы придает бум стоять. Подсветка размещается в нижней части подставки под пользовательские платформы визуализации с стеклянным верхом (рис. 3C), которая позволяет пластин хемотаксис анализа для освещения снизу. «Измерение и автоматики" программного обеспечения (National Instruments) используется для захвата изображений. Материалы для этой визуализации станции созданы аналогичные тем, которые ранее опубликованных, ¹² и может быть найден в таблице конкретных реагентов и оборудования.

8. Представитель Результаты:

Типичный наивный индекс хемотаксиса (ДИ) для дикого типа червей на 10% бутанон составляет около 0,2 (рис. 4А). ⁶ массированный (1x) или интервала (7x) обучение как правило, повышает хемотаксис индекс 0.7-0.8 в момент времени 0 (рис. 4А, CD), чтобы дать обучения индекс (LI = обученных CI -. наивным CI) ~ 0,6 ^6, узнав, что происходит с массированным или расположенных подготовки очень надежными. Л. И. менее 0,5 обычно возникает, когда Есть проблемы с наивным анализа хемотаксис, и животных есть наивный ДИ от 0,3 и выше. Как правило, это происходит потому, что черви голодают или слишком тесно на выращивании пластины, между отбеливания и начала анализа, или черви сидеть слишком долго в M9 буфера между моет и начинают голодать, экологическое запахов может также увеличить наивные CI. Starved червей значительно выше, наивные ДИ 10% бутанон (рисунок 4B) ^6. Мы считаем, что проблемы с наивным хемотаксис, как правило, решен с улучшением ухода червя и культивирования.

Продолжительность памяти в этих тестах является время, которое требуется для индекса хемотаксис сразу после тренировки, чтобы вернуться к наивным уровней, когда обучение индекс = 0. В животных дикого типа, краткосрочные ассоциативная память обычно начинает снижаться на 1 час после массированного обучения длится около 2 часов, и не зависит от фактора транскрипции CREB (рис. 4С). ⁶ Долгосрочные ассоциативной памяти обычно не начинается значительное снижение до 16 часов после расположенных обучение, длится до 40 часов, и CREB-зависимые (рис. 4Д) ⁶ Долгосрочные ассоциативной памяти не может полностью реализовать свой ​​потенциал в нескольких случаях: (1). черви не хватает OP50 Е. палочки во время 30-минутных периодов кондиционирования; (2) бактерии остаются в буфере M9 при голодании периоды; или (3) черви были повреждены во время анализа (например, черви пипеткой против стороны трубки).

Результаты, как правило, статистически значимы при 4 и более хемотаксис испытаний анализа выполняются в генотипе в момент времени. Эксплуатируя шесть повторяет в генотипе обычно дает очень важные результаты, не становясь слишком много для обработки, однако начинающим можете начать только с тремя повторяет. Вообще, работа с 2-3 генотипов или условий, в то время, что удобно для тех, кто имеют опыт с этими обучения и памяти анализов.

Ручной подсчет червей на пластинах хемотаксис анализа является очень много времени, можно добавить изменчивость между экспериментами или лаборатории товарищей, а также может ввести предубеждения при анализе и яnterpreting данных. Worm подсчета, анализа изображений (раздел 6) стандартизирует сбор и анализ данных по лаборатории, и в среднем, сокращение времени анализа данных для опытных членов лаборатории, чтобы 1 / 5 часть, что необходимо для ручного подсчета. При сравнении хемотаксис индексы рассчитаны с использованием ручного учета червь для тех, которые определены с помощью программного обеспечения Count_worms, находим, средняя ошибка 3,07 (± 1,19)%.

День 1
Время	Шаг
9:00	1 час голодать в буфер М9 Начало наивные хемотаксис анализа
10:00	Условие # 1 (60 мм NGM пластин с пищей и бутанон), 30 мин Конец наивным хемотаксис анализа
10:30	Голодать # 1 (60 мм NGM пластин), 30 мин
11:00	Условие № 2, 30 мин
11:30	Голодать № 2, 30 мин
12:00	Условие № 3, 30 мин
12:30	Голодать № 3, 30 мин
1:00	Условие № 4, 30 мин
1:30	Голодать № 4, 30 мин
2:00	Условие № 5, 30 мин
2:30	Голодать # 5, 30 мин
3:00	Условие № 6, 30 мин
3:30	Голодать № 6, 30 мин
4:00	Условие № 7, 30 мин
4:30	Начните 0-ч хемотаксис анализа Передача оставшихся червей провести пластины для 16-40 часов
5:30	Конец 0-ч хемотаксис анализа
День 2
Время	Шаг
8:30	Начало 16-ч хемотаксис анализа
9:30	Конец 16-ч хемотаксис анализа

Таблица 1. Представителю график долгосрочных ассоциативного анализа памяти. В этом примере анализа начинается 1-й день в 9 утра с 1-часовой голодать. 30-мин состоянии и голодать периоды чередуются, пока черви были обусловлены семь раз. Хемотаксис анализы выполняются в начале (наивные) и конце (0 ч) обучения. Общее время выполнения от начала до конца на 8,5 часа. Черви на удержание пластины проходят тестирование на хемотаксис к бутанон, начиная со 2-й день, 16-40 часов после тренировки.

Рисунок 1. Краткосрочные и долгосрочные ассоциативный анализ рабочих процессов памяти. () Рекомендуемые сроки подготовки, ведущих к день анализы выполняются. (Б) Краткосрочные ассоциативный анализ памяти: Starved черви выдержать в течение 1 часа и испытан немедленно 1x обучения (0 мин.) С помощью анализов хемотаксис, или переносится на проведение пластин с пищей в течение 0,5, 1 или 2 часа после кондиционирования. (C) Долгосрочные ассоциативный анализ памяти: Starved животные получают 7 учебных блоков кондиционирования / голодают до проверки в целях обучения или LTAM 16-40 часов после тренировки.

Рисунок 2. Хемотаксис анализа установки. () Схема пластины анализа хемотаксис. Малый пятна добавил к пластине с помощью линейки или других руководящих устройства для обозначения происхождения (внизу) и бутанон и этанола (левая и правая) пятен на пластине. (B) 1 мкл NaN ₃ добавляется бутанон и EtOH пятна. (C) 1 мкл каждого из 10% бутанон и 95% этанола добавляются пятна на левую или правую сторону пластины. (D) 200-400 червей приостановлено в M9 буфером добавляются в начало пластины. (Е) KimWipe скручены в точке используется для поглощения M9 буфера и освобождение червей на анализ пластины.

Рисунок 3. Worm подсчета с анализа изображений. () Пример "count_worms_v0.5.3" образ окне выбора частицы. Программа открывает оригинальную высококонтрастный черно-белое изображение (слева), автоматически всплывает окно с thresholded изображения (в середине). Прямоугольник инструмент может быть использован для выделения и устранения нежелательного не-червя "частиц", таких как анализ пластины марок (1), плиты края (2), или агар проколы (3). (B) Изображение Мерфи лаборатории хемотаксис станции визуализации анализа. Пластины Хемотаксис анализа освещены снизу для создания изображений с высоким контрастом, необходимых для анализа. (C) Схема на заказвизуализации платформа, используемая на станции визуализации хемотаксис.

Рисунок 4. Типичными ассоциативного обучения и памяти результатов. (А) индекс наивным хемотаксис дикого типа червей до 10% бутанон увеличивается при массированной (1x) обучения. Узнал ассоциация требует спаривания пищи (OP50 кишечная палочка) и бутанон. Номера выше бары представляют "Обучение Index" (LI = CITrained - CI _{Наивные).} (B) дикого типа наивный хемотаксис до 10% бутанон значительно возрастает, когда черви голодали в течение 16 часов. Панели AD взяты из Кауфман и соавт., 2010. ⁶ (C) дикого типа краткосрочных ассоциативной памяти длится около 2 часов, и не зависит от фактора транскрипции CREB. (D) дикого типа долгосрочного ассоциативной памяти длится около 40 часов, и CREB-зависимыми.

Дополнительная информация

• Нажмите здесь для получения "imoverlay.m" файл .
• Нажмите здесь для получения "count_worms_image.m" файл .
• Нажмите здесь для получения "count_worms_directory.m" файл .
• Нажмите здесь для получения "cellwrite.m" файл .

Discussion

C. Элеганс обонятельных ассоциативного обучения и памяти анализов, представленные здесь различать процессы массированных обучения, расположенных обучения, кратковременной памяти, и долговременная память. Эти анализы полагаться на способности червей "в смысле пищевых и химических запахов в окружающей их среде ^1,2 и формировать положительные ассоциации между ними. ⁶ Таким образом, тесты очень чувствительны к голоду в стартовом популяции животных, и большое внимание должно быть приняты для обеспечения того, чтобы черви сыты до и после тренировки. Одноместный массированная подготовка дает краткосрочный ассоциативной памяти. Увеличение числа периодов и кондиционирования расположенных парадигмы обучение имеет решающее значение для достижения долгосрочных ассоциативной памяти в C. Элеганс, как и в других организмах. ^6,8 Возможно, этот анализ может быть изменен, чтобы производить долгосрочные воспоминания о связи между различными условных и безусловных раздражителей.

Наши ассоциативного обучения и памяти анализов могут быть использованы для сравнения обучения и памяти, поддерживаемые дикого типа старения или генетические мутанты животных. Например, в то время как ассоциативное обучение и долгосрочные ассоциативной памяти способности снижение старения дикого типа червей, обучения сохраняется дольше с возрастом у животных с пониженным сигнализации инсулина, а обучение и память сохраняется дольше с возрастом у calorically ограничено животными ^6. Эти анализы также поддаются лечению RNAi или фармакологических манипуляций C. Элеганс. Например, лечение червей DAF-2 RNAi улучшает краткосрочные и долгосрочные ассоциативной памяти, и наоборот, блокирования транскрипции генов и синтеза белка с наркотиками (актиномицин D и циклогексимид, соответственно) в течение интервала обучение нарушает долгосрочного формирования памяти. ⁶

Долговременная память является процессом, который имеет решающее значение для выживания у всех животных, и кажется, что многое из молекулярных машин, участвующих в память о павловский ассоциации сохраняется от червей до млекопитающих. ⁶ способность различать и тест ассоциативного обучения, коротких и долгосрочной перспективе памяти с помощью этих анализов обонятельных делает C. Элеганс отличная система для дальнейшего изучения памяти, и может дать представление о нейродегенеративных процессов, которые приводят к потере обучения и памяти у людей.

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Sodium Azide		Fisher Scientific	S227	Prepare 1 M concentration in distilled water
Ethyl Alcohol 190 Proof		Pharmco-Aaper	DSP-CT-18	>95% Ethanol may have impurities that interfere with chemotaxis assays
2-Butanone 99+%		Acros	14967-0010
Basler IEEE-1394/FireWire Area Scan CMOS Camera		Edmund Optics	NT56-683
InfiniMite Video Lens – Alpha Industrial		Edmund Optics	NT56-202
Dolan-Jenner MI-150 Fiber Optic Illuminator		Edmund Optics	NT55-718
8” x 8” Backlight		Schott Fostec	A08927
Standard Boom Stand		Edmund Optics	NT54-120
3/4” Post Adaptor for Boom Stands		Edmund Optics	NT54-124
Standard Fixed 1/4-20 Mounting Plate		Edmund Optics	NT54-122