NanoDrop微量核酸的定量

Summary

NanoDrop微量系统实用，高效的替代传统的核酸定量方法的使用是通过两个微量核酸定量协议的示范。

Abstract

生物分子检测，不断地被开发使用的材料逐步数额较小，往往排除了使用传统的试管为基础的手段，为那些可以进行微量定量的核酸定量。

NanoDrop微量样品保留系统（Thermo Scientific的NanoDrop产品）功能相结合光纤技术和自然表面张力特性，捕捉和保留微量的样品，独立于传统的遏制仪器，如试管或毛细血管。此外，该系统采用更短的路径长度，在一个广泛的核酸浓度测量的结果，从根本上消除了需要进行稀释。波谱分析所需的样本量的减少也有利于整个许多分子的工作流程纳入额外的质量控制步骤，提高效率，并最终导致下游的结果，以更大的信心。

有限质量高灵敏度荧光分析的需求也出现了与最近的实验进展。使用相同的微量样品保留技术，荧光测量可能与2μL材料，使荧光检测量的需求将大大减少。 10μL或更少的这种microreactions现在可以使用一个专用的微量fluorospectrometer。

两个微量核酸定量协议将表明，使用集成的采样系统作为替代传统的试管为基础的协议的实际保留。首先，直接的A260吸光度的方法，使用微量分光光度计描述。这是一个基于荧光的方法，使减少量的荧光反应，用微量fluorospectrometer示范。这些新技术使核酸的浓度从1 pg /μL的15,000纳克/μL样品消耗最小的评估。

Protocol

1。微量核酸定量使用NanoDrop 2000C分光光度计

1. 首先，微量分光光度计样品保留系统的上部和下部的光学表面清洁干净的去离子水的2至3μL，吹打到较低的光学表面。
2. 关闭的杠杆臂，确保上层基座与去离子水接触。抬起杠杆臂和一个清洁，干燥，无尘的实验室擦拭光学表面擦去。
3. 打开NanoDrop软件，并选择核酸应用程序。使用一个小批量，校准移液器1缓冲液配药到较低的光学表面，以执行一个空白的测量。下的力臂，并选择“空白”，在核酸应用。
4. 一旦空白测量完成后，两个光学表面与一个清洁，干燥，无尘的实验室擦拭干净。
5. 选择适当的常数要测量的样品。
   

   样品类型	选择选项	用于计算含量恒定
   双链DNA	DNA的50	50
   单链DNA	DNA的33	33
   核糖核酸	RNA - 40	40
   寡糖	自定义	15-150

   表1：典型的核酸直接A280吸光度测量，使用一个NanoDrop微量分光光度计，一个传统的试管为基础的分光光度计使用一个TrayCell微蜂窝比色皿，在结合PicoGreen检测微量NanoDrop fluorospectrometer的浓度范围。
6. 免除到较低的光学基座1μL的核酸样品，并关闭力臂。由于测量是独立的体积，样品只需要，弥合两者之间的光学表面为测量的差距。
7. 在应用软件中，选择“测量”。该软件会自动计算出的核酸浓度和纯度比例。下面的示例测量，审查的光谱输出。
8. 该软件会自动计算出的核酸浓度和纯度比例。样品的测量，光谱图像，以评估样品的质量审查。
9. 一个典型的核酸样本，将有一个非常有特点的姿态。
   
   图1一个典型的核酸样本将有一个非常有特点的姿态。
10. 与特定的核酸分离技术相关的常见污染物的来源包括苯酚/ Trizol法和列提取。在苯酚/ Trizol法提取的情况下，残留试剂的污染可能是由220至240 nm之间的异常光谱，以及在260〜280 nm区域的变化。相反，从列提取的残留胍可能导致附近230纳米的高峰期，在从230纳米到约240纳米的槽的转变。
    
    图2样品B和C的高峰和低谷的转变相比，样品A说明如何污染物可以影响核酸样品的光谱。
11. 为了准确地评估样品的质量，260/280或二百三分之二百六十○比率应在与整体的光谱质量结合分析。纯核酸通常产量的1.8〜260/280的比例和DNA和RNA的2.0〜260/280的比例，分别。这个比率是依赖于用于空白和样品测量的缓冲pH值和离子强度。酸性溶液中会根据代表0.2-0.3的比例，而一个基本的解决方案将超过代表比例由0.2-0.3。显着不同纯度率可能表明存在蛋白质，酚或其他污染物，达到或接近280 nm处的强烈吸收。二百三十零分之二百六十零纯度比一个“纯”核酸一般在1.8-2.2范围内的值的第二项措施是DNA的纯度。纯度的比例明显低于预期值低可能表明所使用的隔离技术，可能需要进一步优化。
12. NanoDrop分光光度计也可以用来量化的蛋白质，使用直接吸光度或蛋白质比色法。为了确保正确的列形成和重复性，2μL的样品应为蛋白质样品。请参考以下的朱庇特视频：微量法测定蛋白浓度使用NanoDrop 分光光度计 http://www.jove.com/index/Details.stp?ID=1610

2。高灵敏度的微量核酸定量使用NanoDrop 3300 Fluorospectrometer

1. 为了证明高灵敏度的微量核酸定量使用NanoDrop 3300，PicoGreen荧光试剂盒使用。首先，室温平衡试剂盒标准和所有核酸样品。荧光的样品对光敏感，应保存在琥珀或铝包裹管。
2. PicoGreen工作将需要的解决方案，以及来衡量所有的标准和样品准备足够的1X TE缓冲液。准备无核酸水每制造商的协议所提供的20X TE缓冲液稀释1xTE缓冲区。反应体积的范围可以从200μLUL低至10。在这个例子中，10μL的反应体积会有所准备。
3. 准备在2X最终所需浓度无核酸小瓶或试管连续稀释的双链DNA标准。标有“无核酸琥珀色或金属箔覆盖的管个人转移到5μL每个稀释的dsDNA标准。
4. 分装5μL适当标记的核酸无琥珀色或金属箔覆盖管到每个感兴趣的双链DNA样本。
5. 根据制造商的协议，准备PicoGreen工作液。包含标准或利益的样品（5μL在这个例子中）转让PicoGreen工作液等体积每管。
6. 结合1X TE缓冲液和PicoGreen工作液等量准备阴性对照，作为对照品溶液。
7. 每个反应管中的内容进行彻底混合轻柔吹打，并在室温下孵育5分钟的反应。所有的标准品和样品相同的温度测量前应平衡，荧光信号受温度影响。
8. 为了准备仪器进行测量，先清洁的样品保留系统的下限和上限的表面。吸取2至3μL去离子水到较低的光学表面，然后关闭打开的杠杆臂，并用不起毛的干净无污点的上部和下部的底座，实验室擦拭。确保表面皮棉，然后再继续作为皮棉可以表现出荧光激励源的存在，可能会干扰测量。
9. 打开仪器软件，选择“核酸”应用程序，并选择“PicoGreen双链DNA”选项。
10. 空白的文书，加入2μL的1X TE较低的底座，关闭的手臂，并选择“空白”，在仪器软件领域。一旦完成空白，污点从样品保留系统两面空白的解决方案。
11. 轻柔吹打混合对照品溶液。使用低保留的提示，加入2微升到较低的底座和密切的手臂。
12. 选择测量类型中的“参考”，然后选择所需的单位。点击“测量”来启动测量周期。
13. 当测量周期完成后，打开手臂和彻底印迹样品保留系统表面。测量高达五复制参考，使用为每个复制的新鲜等份。
14. 额外的标准，建立标准曲线，重复的过程。可用于最多七个标准。该软件的设计能够存储多达五个，每个标准重复。重复的标准是平均生成一个自动确定从该样品浓度的标准曲线。
15. 标准曲线一旦完成后，选择“样本”标签，进入各自的样品编号信息，并测量每个未知样品。

Discussion

这里介绍的定量协议是基于最广泛接受的微量系统。这种系统提供了实用的替代传统的核酸定量方法，依赖于更大的样品量和遏制仪器的使用。

NanoDrop微量技术采用了一种依赖对所测样品，形成液柱的表面张力特性的样品保留系统。重要的是，样品与适当的列形成上下光学测量表面接触。如果在任何点的测量结果似乎不准确或不重复，这是最有可能的样本异质性或液柱断裂的结果。

洗涤剂和异丙醇的清洁剂，因为它们可能uncondition基座测量表面不建议。一个无条件的基座已经失​​密时，会发生底座的疏水表面性质，导致在一个扁平化的样品液滴。在测量过程中，无条件的底座可以导致液柱断裂。

图3。无条件的表面特征是由水滴压扁。

Uncondtioned基座表面，可翻新使用NanoDrop立柱翻新剂（PR - 1，Thermo Scientific的NanoDrop产品）。一个翻新复合一层薄薄的上部和下部的底座表面，让其干燥〜30秒，然后使用一个清洁，干燥，无尘的实验室擦拭磨去。成功修复的状态是由水珠串适用于底部的基座表面时，液滴的特点。

图4：一个翻新的表面特征是由水滴钉珠。

微量定量系统，大大降低了样品消耗和更传统的量化系统相比显着增加的浓度范围。尽管微量定量甚至常常成为一个涉及有限的细胞团，如穿刺活检和激光捕获显微切割，效率和易于使用这种方法已被广泛接受的替代传统的核酸定量方法的情况下，使技术当样本是充足的。

Materials

Material Name	Type	Company	Catalogue Number	Comment
Name	Company	Catalog Number	Comments
NanoDrop 2000c		Thermo Fisher Scientific	ND-2000C
NanoDrop 3300		Thermo Fisher Scientific	ND-3300