Kwantitatieve analyses van alle Influenza A Virale Hemagglutinins en neuraminidases gebruik van Universal Antistoffen Type in de eenvoudige Slot Blot Assays

Een eenvoudige slot blot methode werd ontwikkeld voor de kwantificering van influenza virale hemagglutinine en neuraminidase met behulp van universele antilichamen gericht hun meest geconserveerde sequenties geïdentificeerd door middel van bioinformatica analyses. Deze innovatieve aanpak kan een nuttig alternatief voor de kwantitatieve bepaling van alle virale hemagglutinine en neuraminidase.

Hemagglutinine (HA) en neuraminidase (NA) zijn twee oppervlakte-eiwitten van influenza virussen waarvan bekend is dat een belangrijke rol spelen in de virale levenscyclus en de inductie van beschermende immuunrespons ^1,2. Aangezien de belangrijkste doelstelling voor neutraliserende antistoffen, wordt HA momenteel gebruikt als het griepvaccin potentie marker en wordt gemeten door een radiale immunodiffusie (SRID) ^3. Echter, de afhankelijkheid van SRID op de beschikbaarheid van de overeenkomstige subtype-specifieke antisera zorgt voor een minimum van 2-3 maanden vertraging voor de introductie van elke nieuwe vaccin. Bovendien, ondanks de bewijzen dat NA ook beschermende immuniteit ^4, het aantal NA in griepvaccins is nog niet gestandaardiseerd te wijten aan een gebrek aan geschikte reagentia of analysemethode ⁵ induceert. Zo simpel alternatieve methoden in staat te kwantificeren HA en NA antigenen zijn wenselijk voor een snelle release en een betere kwaliteitscontrole van griepvaccins.

Universeel geconserveerde gebieden in alle beschikbare influenza-A-HA en NA sequenties werden geïdentificeerd door bioinformatica analyses ^6-7. Een sequence (aangeduid als Uni-1) werd geïdentificeerd in het enige universeel bewaard epitoop van HA, de fusiepeptide ^6, terwijl de twee geconserveerde sequenties werden geïdentificeerd in neuraminidases, een dicht bij de enzymatische actieve site (aangeduid als HCA-2) en de andere dicht bij de N-terminus (aangeduid als HCA-3) ^7. Peptiden met deze aminozuursequenties werden gesynthetiseerd en gebruikt om konijnen voor de productie van antilichamen immuniseren. Het antilichaam tegen de Uni-1 epitoop van HA in staat was om te binden tot en met 13 subtypen van het influenza A HA (H1-H13), terwijl de antistoffen tegen de HCA-2 en HCA-3 regio's van NA in staat waren bindend voor alle negen NA subtypes. Alle antilichamen toonde opmerkelijke specificiteit tegen de virale sequenties, zoals blijkt uit de constatering dat er geen kruisreactiviteit met eiwitten allantoïsche was gedetecteerd. Deze universele antilichamen werden vervolgens gebruikt om slot blot assays te ontwikkelen voor HA en NA in het influenza-A-vaccins te kwantificeren, zonder de noodzaak van specifieke antisera ^7,8. Vaccin monsters werden aangebracht op een PVDF-membraan met behulp van een slot blot apparaat samen met de referentie-normen verdund tot verschillende concentraties. Voor de detectie van HA, werden monsters en de standaard eerste verdund in Tris-gebufferde zoutoplossing (TBS) met 4M ureum, terwijl voor het meten van de NA ze werden verdund in TBS met 0,01% Zwittergent als deze voorwaarden significant de detectie gevoeligheid verbeterd. Na de vaststelling van de HA en NA antigenen door immunoblotting met hun respectieve universele antilichamen werden signaal intensiteiten gekwantificeerd door densitometrie. Bedragen van de HA en NA in de vaccins werden vervolgens berekend met behulp van een standaardcurve opgesteld met het signaal intensiteit van de verschillende concentraties van de gebruikte referenties.

Gezien het feit dat deze antilichamen binden aan universele epitopen in HA of NA, kunnen geïnteresseerde onderzoekers gebruiken als research tools in immunoassays andere dan de sleuf blot alleen.

1. Voorbereiding van de reagentia en apparatuur

1. Voordat u begint met het slot blot procedure, voor te bereiden 20_mls van 4M ureum-oplossing in Tris-gebufferde zoutoplossing (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7,6) (TBS) voor het hemagglutinine, of HA, slot blot, of 20_mls van een 0,01% Zwittergent oplossing in TBS voor de neuraminidase, of NA, slot blot. Terwijl 4M ureum moet vers worden bereid elke keer, een 10% Zwittergent voorraad oplossing in dH ₂ O is stabiel gedurende ten minste 6 maanden bij kamer.......

Kwantitatieve bepaling van influenza virale HA en NA zijn van cruciaal belang voor het onderzoek naar vaccins en ontwikkeling sinds deze twee oppervlakte-eiwitten zijn de belangrijkste virale componenten induceren van immuunreacties ^6-11. Eerder gerapporteerde immunologische methoden voor de detectie van deze eiwitten nodig stam specifieke antilichamen. De eenvoudige, reproduceerbare en snelle slot blot methode om de HA en NA-antigenen hier beschreven kwantificeren zijn geschikt voor alle influenza-A-virale H.......

De auteurs willen graag aan mevrouw Monika Tocchi bedanken voor de redactionele herziening van het manuscript. AMH wordt ondersteund door een beurs van King Abdulaziz University, door middel van de Saoedi-Arabische Cultureel Bureau in Canada.