ניתוח כמותי של השפעת כל סוג Hemagglutinins ויראלי ו Neuraminidases באמצעות נוגדנים יוניברסל מבחני כתם פשוט חריץ

שיטה פשוטה כתם חריץ פותחה עבור כימות של hemagglutinin שפעת ויראלי neuraminidase באמצעות נוגדנים אוניברסלי מיקוד רצפים שימור ביותר שלהם מזוהה באמצעות ניתוחים ביואינפורמטיקה. גישה חדשנית זו עשויה לספק חלופה שימושי להגדרה כמותית של hemagglutinin כל נגיפיים neuraminidase.

Hemagglutinin (HA) ו neuraminidase (NA) הם שני חלבונים פני השטח של נגיפי שפעת אשר ידועים תפקיד חשוב במחזור החיים ויראלי הגיוס של ^1,2 התגובות מגן החיסון. כאשר המטרה העיקרית נוגדנים מנטרלים, HA משמש כיום גם את הסמן חיסון שפעת הפוטנציאל נמדדת immunodiffusion רדיאלי יחיד (SRID) ^3. עם זאת, התלות של SRID על הזמינות של antisera המקביל תת ספציפיים הגורמים מינימום של 2-3 חודשים עיכוב לשחרורו של חיסון כל חדש. יתר על כן, למרות העדויות כי NA גם גורם החסינות ^4, כמות NA בחיסונים לשפעת אינה סטנדרטית אך בשל חוסר של ריאגנטים המתאימים או שיטה אנליטית ^5. לכן, שיטות חלופיות פשוט מסוגל לכימות אנטיגנים HA ו NA רצויות לשחרור מהיר, בקרת איכות טובה יותר של החיסונים לשפעת.

אזורים שמורים אוניברסלי ב שפעת כולם זמינים HA ו NA רצפים זוהו על ידי מנתח ביואינפורמטיקה ^6-7. אחת ברצף (יועד Uni-1) זוהה epitope רק את נשמרת אוניברסלית של HA, הפפטיד היתוך ^6, בעוד שני רצפים שימור זוהו neuraminidases, אחד קרוב באתר הפעיל האנזימטית (יועד HCA-2) ואת קרובים אחרים הסופית-N (יועד HCA-3) ^7. פפטידים אלו רצפים של חומצות אמיניות היו מסונתז ומשומשים לחסן ארנבות לייצור נוגדנים. נוגדנים נגד epitope Uni-1 של HA היה מסוגל להיקשר 13 subtypes של שפעת A HA (H1-H13) ואילו נוגדנים נגד HCA-2 ו HCA-3 אזורים של NA היו מסוגלים מחייב את כל 9 תת NA. כל הנוגדנים הראו סגוליות מדהים נגד רצפים ויראלי כפי שמעידים התצפית שלא לחצות תגובתיות לחלבונים allantoic זוהה. נוגדנים אלה אוניברסלי שימשו אז לפתח כתם מבחני חריץ לכמת HA ו NA של שפעת חיסונים ללא צורך antisera ספציפי ^7,8. דגימות חיסון יושמו על קרום PVDF באמצעות מנגנון כתם חריץ יחד עם סטנדרטים התייחסות בדילול לריכוזים שונים. לצורך זיהוי של HA, דגימות תקן היו בדילול הראשון טריס שנאגרו מלוחים (TBS) המכיל אוריאה 4M בעוד למדידת NA הם מדולל TBS המכילה 0.01% Zwittergent התנאים האלה שיפרה בצורה משמעותית את רגישות הזיהוי. בעקבות גילוי של HA ו NA על ידי אנטיגנים immunoblotting עם נוגדנים אוניברסלי שלהם, בעוצמות האות היו לכמת ידי צפיפות. סכומי HA ו NA בחיסונים חושבו לאחר מכן באמצעות עקומת סטנדרט הוקמה עם עוצמות אות הריכוזים השונים של הפניות בשימוש.

בהתחשב בכך נוגדנים אלה נקשרים epitopes אוניברסלי HA או NA, החוקרים מעוניינים יכול להשתמש בהם ככלי מחקר immunoassays מלבד כתם חריץ בלבד.

1. הכנה של ריאגנטים וציוד

1. לפני שמתחילים את ההליך כתם חריץ, להכין 20_mls של פתרון אוריאה 4M ב-טריס בופר סליין (20 mM טריס, 137 mM NaCl, pH 7.6) (TBS) עבור hemagglutinin, או ארכיאולוגיות, כתם חריץ, או 20_mls של 0.01% Zwittergent פתרון TBS עבור neuraminidase, או NA, כתם ח.......

קביעה כמותית של שפעת נגיפית HA ו NA הם קריטיים עבור מחקר ופיתוח החיסון שכן אלה שני חלבונים פני השטח הם מרכיבים נגיפיים החשוב ביותר גרימת התגובה החיסונית ^6-11. שיטות אימונולוגיות דיווחו בעבר לצורך זיהוי של חלבונים אלה דורשים מאמץ נוגדנים ספציפיים. כתם פשוט, לשחזור מ.......

המחברים מבקשים להודות לגברת מוניקה Tocchi לבדיקה העריכה של כתב היד. AMH הוא נתמך על ידי מלגה מהמלך Abdulaziz University, דרך סעודיה תרבות הלשכה בקנדה.