Analisi quantitativa di tutti influenza di tipo A Hemagglutinins e neuraminidasi virale utilizzando anticorpi Universale di saggi semplice Slot Blot

Un metodo semplice macchia di slot è stato sviluppato per la quantificazione del emoagglutinina e neuraminidasi dell'influenza virale utilizzando anticorpi universali indirizzare le proprie sequenze più conservate identificate attraverso l'analisi bioinformatica. Questo approccio innovativo può fornire una valida alternativa alla determinazione quantitativa di tutti i emoagglutinina e neuraminidasi virale.

Emoagglutinina (HA) e neuraminidasi (NA) sono due proteine ​​di superficie dei virus influenzali, che sono noti per svolgere un ruolo importante nel ciclo di vita virale e l'induzione di risposta immunitaria protettiva ^1,2. Come l'obiettivo principale per gli anticorpi neutralizzanti, HA è attualmente utilizzato come indicatore la potenza del vaccino influenzale ed è misurata dal singolo immunodiffusione radiale (SRID) ^3. Tuttavia, la dipendenza della SRID sulla disponibilità del corrispondente sottotipo-specifici antisieri causa un minimo di 2-3 mesi di ritardo per il rilascio di ogni nuovo vaccino. Inoltre, nonostante le prove che la NA induce anche un'immunità protettiva ^4, l'importo di NA nei vaccini influenzali non è ancora standardizzata a causa della mancanza di reagenti appropriati o metodo di analisi ^5. Così, semplici metodi alternativi in ​​grado di quantificare antigeni HA e NA sono desiderabili per rilascio rapido e miglior controllo della qualità dei vaccini antinfluenzali.

Regioni universalmente conservato in tutte le influenzale disponibile A HA e NA sequenze sono state identificate da analisi bioinformatiche ^6-7. Una sequenza (designato come Uni-1) è stato identificato nel solo epitopo universalmente conservato di HA, il peptide di fusione ^6, mentre due sequenze conservate sono stati identificati in neuraminidasi, una vicino al sito attivo enzimatico (designato come HCA-2) e il altro vicino alla N-terminale (designato come HCA-3) ^7. Peptidi con queste sequenze di amminoacidi sono stati sintetizzati e usati per immunizzare i conigli per la produzione di anticorpi. L'anticorpo contro l'Uni-1 di epitopo HA è stato in grado di legarsi a 13 sottotipi di influenza A HA (H1-H13), mentre gli anticorpi contro l'HCA-2 e HCA-3 regioni di NA erano in grado di legare tutti i 9 sottotipi di NA. Tutti gli anticorpi hanno mostrato notevole specificità contro l'sequenze virali come dimostra l'osservazione che non cross-reattività alle proteine ​​allantoide è stato rilevato. Questi anticorpi universale sono stati poi utilizzati per sviluppare test macchia di slot per quantificare HA e NA di influenza A vaccini senza la necessità di antisieri specifici ^7,8. Campioni di vaccino sono stati applicati su una membrana PVDF con un apparato macchia di slot con standard di riferimento diluito a concentrazioni diverse. Per la rilevazione di HA, campioni e standard sono stati diluiti in tampone Tris salino (TBS) a base di urea 4M, mentre per la misura di NA sono stati diluiti in TBS contenente 0,01% Zwittergent come queste condizioni significativamente migliorato la sensibilità di rilevazione. In seguito al rilevamento di antigeni HA e NA da immunoblotting con i loro anticorpi rispettivi universale, intensità di segnale sono stati quantificati dalla densitometria. Quantità di HA e NA nel vaccino sono poi stati calcolati utilizzando una curva standard stabilito con l'intensità del segnale della varie concentrazioni dei riferimenti usati.

Dato che questi anticorpi si legano agli epitopi universale in HA o NA, gli investigatori hanno interessato potrà servirsene come strumenti di ricerca in saggi immunologici diversi macchia di slot solo.

1. Preparazione di reagenti e attrezzature

1. Prima di iniziare la procedura di macchia slot, preparare 20_mls di soluzione di urea 4M in tampone Tris salino (20 mM Tris, 137 mM NaCl, pH 7.6) (TBS) per l'emoagglutinina, o HA, macchia slot, o 20_mls di un 0,01% Zwittergent soluzione in TBS per la neuraminidasi, o NA, macchia slot. Mentre urea 4M deve essere preparato fresco ogni volta, una soluzione al 10% in magazzino Zwittergent dH ₂ O è stabile per almeno 6 mesi a temperatura ambiente e possono.......

Determinazione quantitativa di influenza virale HA e NA sono fondamentali per la ricerca di vaccini e lo sviluppo dal momento che questi due proteine ​​di superficie sono componenti virali più importanti che inducono risposte immunitarie ^6-11. Riportato in precedenza metodi immunologici per la rilevazione di queste proteine ​​richiedono anticorpi ceppo specifico. La semplice, riproducibile e veloce metodo blot slot per quantificare gli antigeni HA e NA qui descritti sono adatti per tutte l'influe.......

Gli autori desiderano ringraziare la signora Monika Tocchi per la revisione editoriale del manoscritto. AMH è supportato da una borsa di studio da King Abdulaziz University, attraverso l'Ufficio Cultura saudita in Canada.