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Immunology and Infection
ERRATUM NOTICE
Important: There has been an erratum issued for this article. Read more …シンプルなスロットブロット法は、バイオインフォマティクス解析によって同定された彼らの最も保存された配列を標的とする普遍的な抗体を用いてインフルエンザウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量化のために開発されました。この革新的なアプローチは、すべてのウイルスのヘマグルチニンとノイラミニダーゼの定量に有用な代替手段を提供することがあります。
ヘマグルチニン(HA)とノイラミニダーゼ(NA)はウイルスのライフサイクルと防御免疫反応の1,2の誘導に重要な役割を果たすことが知られているインフルエンザウイルスの2つの表面蛋白質である。中和抗体の主要なターゲットとして、HAは現在、インフルエンザワクチンの効力のマーカーとして使用され、一元放射免疫拡散(SRID)3によって測定されます。しかし、対応するサブタイプ特異的抗血清の可用性にSRIDの依存性はすべての新しいワクチンのリリースのための2-3ヶ月の遅延の最小値になります。また、NAにも防御免疫4を誘発するという証拠にもかかわらず、インフルエンザワクチンのNAの量がまだのために適切な試薬や分析法5の欠如に標準化されていません。このように、HAとNA抗原を定量することができるシンプルな代替方法は、Rapid Releaseとインフルエンザワクチンのよりよい品質管理のための望ましいです。
すべての利用可能なインフルエンザのHAとNAの配列における普遍的に保存された領域は、6月7日バイオインフォマティクス解析により同定した。つの保存配列はノイラミニダーゼ、一酵素活性部位に近い(HCA - 2として指定)とで識別されたうちの一方のシーケンスは、(ユニ- 1として指定)、HA、融合ペプチド6の唯一の普遍的に保存さエピトープが同定されたN -末端に他の近くに(HCA - 3として指定)7。これらのアミノ酸配列を有するペプチドを合成し、抗体の産生のためにウサギを免疫するために使用された。 HAのユニ- 1エピトープに対する抗体は、HCA - 2とNAのHCA - 3の領域に対する抗体は、全9 NA亜型を結合することが可能であった間にインフルエンザHA(H1 - H13)の13サブタイプに結合することができた。尿膜タンパク質との交差反応性が検出されなかったことを観察によって証明されるようにすべての抗体は、ウイルス配列に対して顕著な特異性を示した。これらの普遍的な抗体は、特異的抗血清7,8がなくてもインフルエンザワクチンのHAとNAを定量化するためにスロットブロットアッセイを開発するために使用されていました。ワクチンのサンプルは、種々の濃度に希釈した標準品と一緒にスロットブロット装置を用いてPVDF膜に適用した。 HAの検出のために、サンプルと標準は、最初に希釈したトリス緩衝NAの測定のために彼らはこれらの条件としてZwittergent 0.01%を含むTBSで希釈しながら、4M尿素を含有する生理食塩水(TBS)が有意に検出感度を向上した。それぞれの普遍的な抗体でイムノブロットすることによって、HAとNAの抗原の検出に続いて、信号強度はデンシトメトリーにより定量した。ワクチンのHAとNAの量は、使用される参照の種々の濃度の信号強度と確立された標準曲線を用いて計算した。
これらの抗体は、HAまたはNAのユニバーサルエピトープに結合することを考えると、関心のある研究者は、スロットブロット以外のイムノアッセイで研究ツールとしてそれらを使用することができます。
1。試薬と機器の準備
Name | Company | Catalog Number | Comments |
試薬や機器の名前 | 会社 | カタログ番号 | コメント |
---|---|---|---|
バイオドットSFの精密ろ過装置 | Bio - Rad社 | 170-6542 | |
バイオドットSFフィルターペーパー | Bio - Rad社 | 162-0161 | |
イモビロン- FLトランスファーメンブレン(PVDF) | ミリポア | IPFL00010 | |
真空ポンプ | ミリポア | WP6111560 | |
化学発光Biomaxのライトフィルム | コダック | 178 8207 | |
FluorChemゲルドキュメンテーションシステム | アルファイノテック | 29から008 - 1896X | |
HAとNAの抗原に対する普遍的なウサギ抗体 | UNI - 1(HA)HCA - 2、HCA - 3(NA) | 抗体は、MTAを介して入手するか、以前に6,7を説明した手順にしたがって興味のある研究者によって生成することができます。 | |
インフルエンザワクチンの基準抗原 | CBER / FDAまたはNIBSC | ||
インフルエンザワクチンのサンプル | ほとんどの国で一般的に使用可能 | ||
尿素 | シグマアルドリッチ | U1250 | |
Zwittergent 3月14日洗剤 | カルビオケム | 693017 | |
Tween - 20を | フィッシャーサイエンティフィック | BP337 - 500 | |
ブロッティンググレードブロッカー脱脂粉乳 | Bio - Rad社 | 170-6404 | |
ImmunoPureヤギ抗ウサギIgG(H + L)、共役ペルオキシダーゼ | サーモサイエンティフィック | 31460 | |
SuperSignalウエストデュラエース拡張期間の基板 | サーモサイエンティフィック | 34075 |
Erratum
Erratum: Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot AssaysAn author's affiliation was omitted from the publication of Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.
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