Polymerase Chain Reaction: Basis Protocol Plus Problemen oplossen en Optimalisatie Strategieën

In de biologische wetenschappen zijn er technologische ontwikkelingen die de discipline katapulteren in de gouden tijden van ontdekking. Zo werd bijvoorbeeld op het gebied van microbiologie getransformeerd met de komst van de microscoop Anton van Leeuwenhoek's, waardoor wetenschappers prokaryoten visualiseren voor de eerste keer. De ontwikkeling van de polymerase chain reaction (PCR) is een van die innovaties die de loop van de moleculaire wetenschap met de impact ervan verspreid over talloze subdisciplines in de biologie veranderd. De theoretische proces werd geschetst door Keppe en collega's in 1971, maar het was nog eens 14 jaar tot de volledige PCR-procedure werd beschreven en experimenteel toegepast door Kary Mullis terwijl Cetus Corporation in 1985. Automatisering en verfijning van deze techniek voortgang geboekt bij de invoering van een thermisch stabiele DNA polymerase van Thermus aquaticus bacterie derhalve de naam Taq DNA polymerase.

PCR is een powerful versterking techniek die een ruim aanbod van een specifiek segment van DNA (dat wil zeggen, een amplicon) van slechts een kleine hoeveelheid van het uitgangsmateriaal (dat wil zeggen, DNA-sjabloon of doelsequentie) kunnen genereren. Terwijl eenvoudig en over het algemeen zonder problemen, er zijn valkuilen die de reactie het produceren van valse resultaten bemoeilijken. Wanneer PCR mislukt, kan dit leiden tot veel niet-specifieke DNA-producten van verschillende grootte die worden weergegeven als een ladder of een uitstrijkje van bands op agarose gels. Soms is er geen producten vormen het geheel. Een ander probleem treedt op als mutaties onbedoeld geïntroduceerd in de amplicons, resulterend in een heterogene populatie van PCR-producten. PCR fouten kunnen worden frustrerend, tenzij geduld en voorzichtig het oplossen van problemen worden gebruikt om uit te zoeken en het probleem (s) op te lossen. Dit protocol beschrijft de grondbeginselen van de PCR, is een methode die zal resulteren in een versterking van de meeste doelsequenties, en presenteert strategieën voor het optimaliseren van een reactie. Door het volgen van deze PCR-gids, students moet in staat zijn om:

• Stel reacties en thermische cycli voorwaarden voor een conventionele PCR-experiment
• Begrijpen de functie van verschillende reactiecomponenten en de totale effect op PCR experiment
• Ontwerp en optimaliseren PCR experiment voor DNA-template
• Problemen met niet PCR experimenten