Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Fehlersuche und Optimierungsstrategien

In der biologischen Wissenschaften gab es technologische Fortschritte, die die Disziplin in goldenen Zeitalter katapultieren Entdeckungsreise. Zum Beispiel wurde das Gebiet der Mikrobiologie mit dem Aufkommen von Anton van Leeuwenhoek das Mikroskop, das die Wissenschaftler zu Prokaryoten zum ersten Mal zu visualisieren erlaubt verwandelt. Die Entwicklung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine jener Innovationen, die den Verlauf der molekularen Wissenschaft mit ihren Auswirkungen Spanning unzählige Teildisziplinen der Biologie verändert. Der theoretische Prozess wurde durch Keppe und Mitarbeitern im Jahr 1971 skizziert, allerdings war es noch 14 Jahre dauern, bis die komplette PCR-Verfahren wurde beschrieben und experimentell angewandt von Kary Mullis, während an der Cetus Corporation im Jahr 1985. Automatisierung und Ausgestaltung dieser Technik weiter mit der Einführung eines thermisch stabile DNA-Polymerase aus dem Bakterium Thermus aquaticus, damit der Name Taq DNA Polymerase.

Die PCR ist eine Powerful Amplifikationsverfahren, die eine hohe Verfügbarkeit von einem bestimmten Segment der DNA (dh, ein Amplikon) aus nur eine kleine Menge des Ausgangsmaterials (dh DNA-Matrize oder Zielsequenz) erzeugen kann. Während in der Regel unkompliziert und problemlos, es gibt Fallstricke, die die Reaktion produzieren falsche Ergebnisse erschweren. Wenn es fehlschlägt PCR lässt sich auf viele nicht-spezifische DNA-Produkte in verschiedenen Größen, die als Leiter oder Abstrich von Bands auf Agarosegelen erscheinen führen. Manchmal bilden keine Produkte überhaupt. Ein weiteres potentielles Problem tritt auf, wenn Mutationen unbeabsichtigt in den Amplikons eingeführt werden, was zu einer heterogenen Population von PCR-Produkten. PCR-Ausfälle werden kann frustrierend es sei denn, Geduld und sorgfältige Fehlerbehebung eingesetzt werden, zu klären und lösen das Problem (e). Dieses Protokoll werden die grundlegenden Prinzipien der PCR, eine Methode bereit, die in der Amplifikation der Zielsequenzen meisten führen wird, und präsentiert Strategien zur Optimierung einer Reaktion. Durch Einhalten dieses PCR, STudents sollte in der Lage:

• Richten Sie Reaktionen und Temperaturwechsel Bedingungen für eine konventionelle PCR-Experiment
• Verstehen Sie die Funktion der verschiedenen Reaktionskomponenten und ihre Gesamtwirkung auf einer PCR-Experiment
• Gestaltung und Optimierung einer PCR-Experiment für jede DNA-Template
• Problembehandlung fehlgeschlagener PCR-Experimente