Reação em Cadeia da Polimerase: Protocolo Basic Plus Estratégias de solução de problemas e otimização

Nas ciências biológicas tem havido avanços tecnológicos que elevaram a disciplina em épocas de ouro da descoberta. Por exemplo, o campo da microbiologia foi transformada com o advento de microscópio Anton van Leeuwenhoek, que permitiu que os cientistas visualizar procariotas, pela primeira vez. O desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase (PCR) é uma dessas inovações que mudaram o curso da ciência molecular com o seu impacto abrangendo subdisciplinas incontáveis ​​na biologia. O processo teórico foi descrito por Keppe e colaboradores em 1971, no entanto, era mais de 14 anos até que o procedimento de PCR completa foi descrito e aplicado experimentalmente por Kary Mullis, enquanto ao Cetus Corporation, em 1985. Automatização e refinamento desta técnica progrediu com a introdução de uma polimerase de ADN termicamente estável a partir do Thermus aquaticus bactéria, consequentemente, o nome da polimerase de DNA Taq.

A PCR é um powetécnica de amplificação rful que pode gerar um grande suprimento de um segmento específico de ADN (ie, um fragmento amplificado) a partir de apenas uma pequena quantidade de material de partida (isto é, o modelo de DNA ou sequência alvo). Embora simples e geralmente sem problemas, existem armadilhas que dificultam a reação produzindo resultados falsos. Quando PCR falhar pode levar a muitos produtos não específicos de ADN de tamanhos variados que aparecem como uma escada ou mancha de bandas no gel de agarose. Às vezes produtos não formam em tudo. Outro problema potencial ocorre quando as mutações são intencionalmente introduzido nos amplicons, resultando em uma população heterogénea de produtos de PCR. Falhas de PCR pode se tornar frustrante a menos paciência e resolução de problemas cuidado são utilizados para classificar e resolver o problema (s). Este protocolo descreve os princípios básicos de PCR, fornece uma metodologia que irá resultar em amplificação de sequências de a maioria dos alvos, e apresenta estratégias para optimizar uma reacção. Ao seguir este guia de PCR, students deve ser capaz de:

• Configure reações e condições ciclos térmicos para um experimento de PCR convencional
• Compreender a função dos componentes de reação diversas e seu efeito global sobre um experimento de PCR
• Projetar e otimizar um experimento de PCR para qualquer modelo de DNA
• Solucionar problemas de experiências fracassadas de PCR