Polymerase Chain Reaction: Basic protokoll Plus Felsökning och optimering strategier

I de biologiska vetenskaperna har det tekniska framsteg som katapult disciplin i gyllene åldern upptäckt. Till exempel inom mikrobiologi transformerats med tillkomsten av Anton van Leeuwenhoek s mikroskop, vilket gjorde forskarna att visualisera prokaryoter för första gången. Utvecklingen av polymerase chain reaction (PCR) är en av de innovationer som förändrat molekylära vetenskap med dess inverkan spänner otaliga subdiscipliner i biologi. Den teoretiska Processen beskrivs av Keppe och medarbetare i 1971, men det var ytterligare 14 år innan hela PCR-metoden beskrevs och experimentellt tillämpas av Kary Mullis medan Cetus Corporation 1985. Automatisering och förfining av denna metod utvecklades med införandet av en termisk stabil DNA-polymeras från bakterien Thermus aquaticus, följaktligen namnet Taq DNA-polymeras.

PCR är en Kraftenrful förstärkningsteknik som kan generera en riklig tillförsel av en specifik DNA-segment (dvs en amplikon) från endast en liten mängd utgångsmaterial (det vill säga, DNA-templat eller målsekvens). Medan enkelt och generellt problemfri, det finns fallgropar som försvårar reaktionen producerar falska resultat. När PCR misslyckas kan leda till många icke-specifika DNA-produkter av olika storlekar som visas som en stege eller smeta av band på agarosgeler. Ibland inga produkter bildas alls. Ett annat potentiellt problem uppstår när mutationer oavsiktligt introduceras i amplikonema, vilket resulterar i en heterogen population av PCR-produkter. PCR-fel kan bli frustrerande om tålamod och noggrann felsökning används för att reda ut och lösa problemet (s). Detta protokoll beskriver de grundläggande principerna för PCR, ger en metod som kommer att resultera i amplifiering av de flesta målsekvenser, och presenterar strategier för optimering av en reaktion. Genom att följa denna PCR guide, students kunna:

• Inrättat reaktioner och termiska cykliseringsbetingelser för en konventionell PCR-experiment
• Förstå funktionen hos olika reaktionskomponenterna och den totala effekten på en PCR-experiment
• Designa och optimera en PCR-experiment för varje DNA-mall
• Felsöka misslyckade PCR-experiment