Visualisatie en genetische manipulatie van dendrieten en stekels in de muis Cerebral cortex en de hippocampus met behulp van<em&gt; In utero</em&gt; Elektroporatie

Summary

Dit artikel beschrijft in detail een protocol bij electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus bij E14.5 bij muizen. We tonen ook aan dat dit een waardevolle methode om dendrieten en stekels te bestuderen in deze twee cerebrale regio's.

Abstract

In utero elektroporatie (IUE) is uitgegroeid tot een krachtige techniek om de ontwikkeling van verschillende regio's in de embryonale zenuwstelsel System ^1-5 te bestuderen. Tot op heden is deze tool is op grote schaal is gebruikt om de regulatie van cellulaire proliferatie, differentiatie en neuronale migratie, met name in de ontwikkelingslanden hersenschors ^6-8 te bestuderen. Hier hebben we onze detail-protocol om electroporate in utero de cerebrale cortex en de hippocampus en het bewijs dat deze aanpak kan worden gebruikt om dendrieten en stekels in deze twee cerebrale regio's te bestuderen te bieden.

Visualisatie en manipulatie van neuronen in de primaire culturen hebben bijgedragen tot een beter begrip van de processen die betrokken zijn bij dendriet, wervelkolom en synaps ontwikkeling. Maar neuronen groeien in vitro niet worden blootgesteld aan alle fysiologische prikkels die dendriet en / of ruggegraat vorming en instandhouding kan van invloed zijn tijdens de normale ontwikkeling. Onze kennis van dendrieten en spines structuren 9. Echter Golgi kleuring als onvoorspelbaar zijn. Inderdaad, worden groepen van zenuwcellen en vezels traktaten willekeurig label, met bijzondere gebieden vaak in de vorm volledig gekleurd zijn, terwijl aangrenzende gebieden zijn verstoken van kleuring. Recente studies hebben aangetoond dat IUE TL constructen een aantrekkelijk alternatief methode dendrieten ruggen en synapses bestuderen mutant / wild-type muizen ^10-11 (figuur 1A) vertegenwoordigt. Bovendien in vergelijking met de generatie van de muis uitsparingen, IUE is een snelle benadering winst en functieverlies studies uitgevoerd in bepaalde populatie van cellen gedurende een bepaalde tijdsperiode. Daarnaast is IUE met succes gebruikt bij induceerbare genexpressie of induceerbare RNAi benadert het verfijnen van de tijdelijke controle over de expressie van een gen of shRNA ^12. Deze voordelen van de IUE hebben dus opened nieuwe dimensies aan het effect van genexpressie / onderdrukking van dendrieten en stekels niet alleen in bepaalde cerebrale structuren (Figuur 1B), maar ook op een bepaald tijdstip van ontwikkeling (figuur 1C) te bestuderen.

Tot slot, IUE is een nuttig instrument om functionele interacties tussen genen die betrokken zijn bij dendriet, wervelkolom en / of synaps ontwikkeling te identificeren. Inderdaad, in tegenstelling tot andere genoverdracht methoden zoals virus, is het eenvoudig om meerdere RNAi of transgenen combineren in celpopulatie.

Kortom, IUE is een krachtige methode die al heeft bijgedragen aan de karakterisering van moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de hersenfunctie en ziekte en het moet ook nuttig zijn bij de studie van dendrieten en stekels.

Protocol

In het Verenigd Koninkrijk, worden muizen gehuisvest, gefokt, en behandeld volgens de richtlijnen goedgekeurd door het ministerie van Binnenlandse Zaken onder het dier (Scientific Procedures) Act 1986.

1. Voorbereiding: DNA-oplossing en naalden

1. Zuiver plasmide DNA met een endotoxine gratis Maxi-prep-kit. Bereid plasmide DNA oplossing voor injectie gewenste concentraties in water en voeg Fast Green (eindconcentratie van 0,05%) injecties visualiseren. De efficiëntie van elektroporatie is sterk afhankelijk van de DNA-concentratie. Een concentratie van 1 pg / pl algemeen gebruikt. Deze concentratie is voldoende om geëlektroporeerde neuronen visualiseren zonder dat de ontwikkeling. Volgens de promoter in de plasmide vector (lage expressieniveau van cytomegalovirus promotor / enhancer sterke expressie van de cytomegalovirus immediate early enhancer en kip β-actine-promoter fusie (CAG) promoter) en de grootte en de stabiliteit van het eiwit uitgedrukt kan deze concentratie worden aangepast (0,25 ug / ul 5 pg / pl).
2. Trek glas naalden met behulp van een micropipet trekker.

2. Voorbereiding van de Chirurgie

1. Autoclaaf chirurgische instrumenten en fosfaatbuffer zoutoplossing (PBS).
2. Bereid analgeticum in PBS (buprenorfine Vetergesic, eindconcentratie van 30 ng / ml). Weeg de zwangere muis en het injecteren subcutaan 0,1 mg / kg Vetergesic ten minste 30 minuten voor de operatie. Gedurende deze tijd, de voorbereiding van de chirurgische gebied. Zet de verwarming pads en het herstel kamer. Leg steriele PBS in warm water bad en alle steriele instrumenten en materialen op steriele doeken. Plaats de platina-elektroden in een PBS gevulde beker en maak verbinding met de electroporator. Vul de naald met de DNA-oplossing met behulp van een microloader tip, sluit u de naald op de capillaire houder en knijp uit de punt van de naald met een tang.

e_title "> 3. chirurgie Voordat DNA-injectie en elektroporatie

1. Verdoof een zwangere muis (E14.5-E15.5) met isofluraan in zuurstof drager (zuurstof 2 l / min) met behulp van een verdovingsmiddel inductie kamer. Wacht tot het dier verliest oprichten van reflex.
2. Breng het dier een "pre-chirurgie" masker. Breng een druppel ooggel op elk oog om ulceratie van de cornea van de ogen te voorkomen, terwijl de moeder is onder algemene verdoving. Gebruik een elektrisch scheerapparaat om het haar van de buik scheren. Maak een keer het geschoren gebied met clorhexidine voor het vliegtuig haren te verzamelen.
3. Breng het dier een tweede masker in het operatiegebied. Plaats de muis met de rug op de mat. Start de operatie als het pedaal reflex is verloren gegaan.
4. Doe masker en steriele handschoenen. Bedek het dier met een steriel laken (met een klein gaatje in de buik) naar de weefsels en instrumenten te voorkomen dat besmet door de gebieden van de huid die niet zijn geschoren en gedesinfecteerd. Reinig het geschoren gebied eent minstens 3 keer met clorhexidine. Gebruik een andere steriele wattenstaafje per keer. Gebruik een scalpel om een ​​verticale insnijding over de middellijn (~ 1 cm lang) maken door de huid. Met behulp van een schaar, een soortgelijke incisie van de spier van de buik langs de linea alba (witte lijn die hoofdzakelijk bestaat uit collageen bindweefsel).
5. Kies de meest toegankelijke embryo's en plaats de ring tang tussen twee embryo's en embryonale zorgvuldig de keten te trekken uit de buikholte. Vanaf dit punt op, hou de embryo's gehydrateerd met een steriele voorverwarmde PBS.

Geen microscoop nodig voor visualisatie.

4. Injectie van DNA en elektroporatie

1. Beginnen met een van de laterale embryo, waardoor het gemakkelijker om waarvan embryo werden geëlektroporeerd houden. Niet te veel trekken aan de embryo's, omdat dit het risico van bloedingen verhogen. Manipuleer de positie van het embryo in de vruchtzak met behulp van de ring pincet enstabiliseren de kop van de embryo's tussen de ringen. Knijp voorzichtig bij het opdrijven van het embryo dichter bij de baarmoederwand.
2. Met de andere hand neemt u de capillaire houder en zorgvuldig steek de naald in het midden van het halfrond aan de laterale ventrikel richten. Op de pedaal om ongeveer 1 ul DNA oplossing gemengd met Fast Green (minder dan 1 pi aan dendrieten bestuderen) injecteren. U moet houden aan de groene kleurstof het vullen van de laterale ventrikel. Kritische stappen: - De scherpte van de naald is van cruciaal belang te doorboren goed de baarmoederwand. Het is belangrijk de beweging van de naald minimaliseren aan het oppervlak van de uteruswand, na het inbrengen in de hartkamer door een vergroting van het gat zal resulteren in het verlies van vruchtwater en embryo dood. Vermijd piercing bloedvaten in de baarmoederwand, omdat dit zal resulteren in een bloeding en embryo dood.
   - Het is belangrijk om geen te grote hoeveelheid DNA injecteren in de laterale ventrikel, omdat het kan veroorzaken, zullenhydrocephalus (geen 2 ui niet meer bedragen dan E14.5). De hoeveelheid DNA is aangepast aan het doel van het experiment. Als 1 pi wordt algemeen gebruikt voor de meeste experimenten wordt een geringere hoeveelheid DNA (ongeveer 0,5 pi) nodig dendrieten en rug analyse. Inderdaad een paar geïsoleerde cellen dienen te worden gericht om te visualiseren en meten van de dendritische prieel van geëlektroporeerde neuronen.
3. Plaats de elektroden op de zijkanten van het embryo kop met de positieve (+) paddle aan dezelfde zijde als de geïnjecteerde ventrikel voor cortex elektroporatie of aan de andere kant van de geïnjecteerde ventrikel voor hippocampus elektroporatie (figuur 2). Breng vijf 30V elektrische pulsen (50 msec duur) op 1 sec intervallen. Kritische stap: Vermijd toepassing van de huidige door de placenta, omdat dit zal resulteren in embryonale sterfte.
   Alle embryo's in een zwangere muis kan worden geëlektroporeerd, meestal met dezelfde DNA-construct om verwarring te voorkomen. Echter, een lange operatie daling is er aan de overleving van embryo's. De buikholte niet langer dan 30 min geopend.

5. Chirurgie Post-elektroporatie

1. Na electroporating de embryo's, toe te voegen PBS in de buikholte en gebruik de ring tang om de baarmoeder hoorn weer op zijn oorspronkelijke locatie. Hecht de buik muur en de huid met Vicryl absorbeerbare hechtingen.
2. Plaats het dier in een herstel van kamer tot hij wakker wordt (meestal 5-10 min) en vervolgens over in een kooi geplaatst op een verwarmingselement.

6. Post-operatie

Controleer het gedrag van de muizen om pijn, lijden of angst te beoordelen en de dieren 24 uur en 48 uur af te wegen na de operatie. Indien nodig, kunnen pijnstillers worden toegediend om de pijn en ongemak te minimaliseren.

7. Weefsel bewerken

Verzamel de geëlektroporeerde embryo's of pups op het embryo of de postnatale fase die nodig is voor het experiment.

ove_content "> - Voor analyse op embryonale stadia (bijvoorbeeld om celproliferatie of migratie te bestuderen):
Euthanaseren moeder via cervicale dislocatie en het verzamelen van de embryo's. Na onthoofding de hersenen, die goed zijn geëlektroporeerd kiezen, zoals aangegeven door de hoeveelheid en de plaats van het fluorescentiesignaal, zichtbaar in de schedel met een fluorescerende binoculaire. Ontleden de hersenen uit de schedel en lossen 's nachts in 4% PFA en breng vervolgens in een 20% sucrose / PBS gedurende de nacht. Insluiten in OCT verbinding invriezen bij -80 ° C en deel met een cryostaat.

- Voor de analyse op postnatale fase (bijvoorbeeld om dendrieten en stekels studie):
Verdoven pups of volwassen muizen met intraperitoneale injectie van pentobarbitone (40-60 mg / kg) en voer transcardial perfusie met PBS, gevolgd door 4% PFA in PBS. Ontleden de hersenen uit de schedel en post-fix in 4% PFA 's nachts. Na het wassen in PBS, onderdeel van de hersenen met behulp van een vibratome (100 micrometer secties voor dendrite analyse). Monteer de secties in Aqua Poly / mount met behulp van 0.16-0.19 mm dik dekglaasjes om beeld dendrieten en stekels.

8. Representatieve resultaten

Figuur 3 toont voorbeelden van geëlektroporeerde cellen in de cerebrale cortex (Figuren 3A, B) in de CA1 (figuren 3C, D) en de dentate gyrus de hippocampus (figuren 3E, F). Wild-type muizen werden geëlektroporeerd in E14.5 een GFP-construct (PCA-b-EGFPm5 demper 3) en geoogst op hersenen dagen na de geboorte (P) 14. Door injectie van een kleine hoeveelheid DNA-oplossing (0,5 ul of minder van een oplossing van 1 pg / pl), worden enkele cellen gelabeld, waardoor de visualisatie van de dendritische arborization geïsoleerde GFP + cellen (figuur 3) en de ruggen bij een grotere vergroting (figuur 4).

Figuur 1. Schematische weergave van elektroporatie protocollen kunnen worden gebruikt om dendrieten en ruggen bestuderen. (A) elektroporatie van een GFP-construct te dendrieten en ruggen vergelijken wild-type en mutante muizen. (B) elektroporatie van GFP-shRNA (GFP tot expressie komen vanaf hetzelfde construct) om dendrieten en ruggen bij muizen werden geëlektroporeerd met een shRNA vergelijken construeren specifiek voor een gen van interesse (X) of een controle shRNA. (C) IUE kan worden gebruikt samen met een Cre induceerbare systeem om expressie van het shRNA beperken tot de gewenste tijdsperiode. In deze proef wordt een vector die een vorm van het Cre-recombinase dat geactiveerd kan worden door 4-hydroxytamoxifen (CAG-ER ^T2 creer ^T2, 1 pg / pl) ¹⁰ wordt geëlektroporeerd met een vector die een specifieke shRNA in Cre afhankelijke wijze (1 pg / pl en met een recombinatie indicator (CALNL-GFP-construct, GFP expressie geïnduceerd door Cre;. 1 pg / pl) ¹⁰ efficiencycy de knockdown kan worden verbeterd door de concentratie van de shRNA evenals meer CAG-ER ^T2 creer ^T2 concentratie.

Figuur 2. Ruimtelijke controle van elektroporatie. Deze figuur toont waar het positioneren van de schoep elektrodes volgens de DNA injectie om de cerebrale cortex of hippocampus gericht.

Figuur 3. Visualisatie van de dendritische prieel van in de baarmoeder geëlektroporeerd cellen in de cerebrale cortex en de hippocampus. (A, B) coronale secties met GFP + piramidale cellen in de hersenschors, (CD) piramidale cellen in CA1 van de hippocampus en (E, F), granule cellen in de dentate gyrus op P14. Een GFP construct (PCA-b-EGFPm5 geluiddemper 3) werd geëlektroporeerd op E14.5. Hogere vergroting foto's (B, D, F) blijkt dat de IUE is een efficiënte methode om dendrieten te visualiseren. Schaal staafjes 50 pm (B, D en F), 150 pm (A, C, E).

Figuur 4. Visualisatie van dendritische 'spines in P14 neuronen die werden in de baarmoeder geëlektroporeerd op E14.5 met een GFP expressie te construeren. (A, B) Hoge vergroting beelden van de stekels van basale dendrieten van de hippocampus piramidale neuronen. Schaal staafjes 5 pm (A) en 2 pm (B).

Discussion

IUE is een krachtig hulpmiddel om de genexpressie te manipuleren niet alleen in de ruimte, maar ook in de tijd. We laten hier zien dat deze techniek kan worden gebruikt voor het visualiseren en genetisch te manipuleren dendrieten en stekels in de cerebrale cortex en de hippocampus van muizen. Naast de eerder genoemde voordelen, zij opgemerkt dat IUE, in tegenstelling tot werkwijze Golgi kan worden gecombineerd met immunohistochemie of in situ hybridisatie, waardoor bijvoorbeeld fenotype geëlektroporeerde cellen. Het is ook belangrijk te vermelden dat deze procedure niet duidelijk hersenen misvormingen, ondanks de relatieve invasiviteit. Daarnaast, op cellulair niveau, is IUE geen wijziging in de elektrofysiologische eigenschappen van de neuronen geëlektroporeerde ^13. Terwijl onze demonstratie richt zich op de visualisatie van dendrieten en spines morfologie, kon IUE van de corticale of hippocampale neuronen op E14.5 ook gebruikt worden om andere ontwikkelingsstoornissen evenementen zoals axon vorming en begeleiding te bestuderen. In toe te voegenbankwezen in, hetzelfde soort protocol kunnen worden uitgevoerd in andere stadia van de embryonale ontwikkeling bij verschillende populaties richten. Zo kan een ontwikkelingsgebied zeer laat corticale elektroporatie paradigma op E18.5 worden uitgevoerd om uitdrukking te rijden in astrocytaire voorlopercellen ^1. Evenzo wordt een elektroporatie van de hippocampus op E14.5 toelaat CA1-CA3 piramidevormige neuron voorlopers en dentaatgroepen granule cellen progenitorcellen richten tegelijkertijd zou een late hippocampus elektroporatie (E18.5 of postnatale) kunnen verschillende getand granule richten voorlopers ^14. In dit geval kan de geïnjecteerde hoeveelheid DNA ook worden verhoogd als de stroomsterkte.

Transgenen geïntroduceerd door IUE lijken te blijven episomale en zijn dus verloren van de cellen na de opeenvolgende celdelingen. In postmitotische cellen zoals neuronen echter de episomale transgenen actief blijven maanden na elektroporatie waarbij langdurige studie ¹³15. In onze studie hebben we waargenomen heldere GFP ⁺ cellen tot 7 weken na de geboorte (het laatste tijdstip analyseerden we) dat aangeeft dat embryonale targeting van corticale of hippocampus neuronale precursoren met behulp van IUE resulteert in een blijvende expressie van het transgen van de vroege ontwikkeling tijdstippen up naar volwassenheid.

Een stroom begrenzing van de techniek is dat het moeilijk is uit te oefenen een goede controle over het totale aantal geëlektroporeerde cellen. Echter, door vermindering van de geïnjecteerde hoeveelheid DNA oplossing, hebben we aangetoond dat het mogelijk is om een ​​aantal cellen labelen en de dendritische arborization geïsoleerde GFP + cellen alsmede de ruggen visualiseren. De afmeting van de getransfecteerde zou ook kunnen worden aangepast door aanpassen van de parameters van de elektroporatie zoals stroomsterkte en het aantal pulsen of de diameter van de schoepen elektroporatie.

Al met al IUE is een methode die is eenvoudig te implementeren, snelle enefficiënt om dendrieten en stekels in vivo te bestuderen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Naam van het serum	Vennootschap	Catalogusnummer	Reacties
			Bereiding van naalden en DNA oplossing voor injectie
Endofree Plasmide Maxi Kit	Qiagen	12362
Fast Green	Sigma	F-7258
Borosilicaatglas haarvaten 1,0 mm OD x 0,58 mm ID	Harvard Apparatuur	30-0016
Microloader tips	Eppendorf	5242956003	Voor Eppendorf pipetten 0,5 pi-10 ul / 2 tot 20 ul
		& Nbsp;	Materiaal voor een operatie
Extra dunne Iris schaar	Fine Science Tools	14088-10
Gebogen tang	Fine Science Tools	91197-00
Ring tang	Fine Science Tools	11103-09
Naaldhouder	Fine Science Tools	12002-12
Graefe tang	Fine Science Tools	11050-10
Vicryl resorbeerbaar garen	Inc (Johnson & Johnson) Ethicon	W9074
Steriele doeken 30cm x 45 cm	Buster	141765
Steriele swabs	Shermond	Huby-340
Wattenstaafjes	Schoon Cross Co, Ltd	1860
Buprenorfine (Vetergesic)	Alstoe Animal Health
Clorhexidine	Vetasept	XHG007
Ooggel Viscotears	Novartis
Isofluraan	Abbott Laboratories	B506
Pentoject, Pentobarbitone Natrium 20%	Animalcare
			Elektroporatie
Electroporator	BTX	ECM830
Platinum Tweezertrode 5mm	BTX, Harvard Apparatus	45-0489
Femtojet microinjector	Eppendorf	5247000030
Voetschakelaar voor Femtojet Microinjector	Eppendorf	5247623002
Capillaire houder	Eppendorf	5176190002
			Tissue verwerking
Paraformaldehyde	Sigma	P6148
Sucrose	VWR (Prolabo)	27480.294
Objectglaasjes	ThermoScientific (Menzel-Glaser)	J1800AMNZ
Dekglaasjes	Menzel-Glaser		22 x 50 mm # 1,5
Aqua Poly / mount	Polysciences, Inc	18606