Identification des

Génomiques, les analyses protéomiques, transcriptomiques, et épigénomiques de tumeurs humaines indiquent qu'il ya des milliers d'anomalies au sein de chaque génome du cancer par rapport aux tissus normaux appariés. Sur la base de ces analyses, il est évident qu'il ya beaucoup d'inconnues pilotes génétiques du cancer ^1. Malheureusement, ces pilotes sont cachés dans un plus grand nombre d'anomalies particulières dans le génome qui ne contribuent pas directement à la formation de tumeurs. Un autre aspect du génome du cancer, c'est qu'il ya grande hétérogénéité génétique au sein des mêmes types de tumeurs. Chaque tumeur peut héberger des mutations différentes qui offrent un avantage sélectif pour la formation de tumeurs ^2. Exécution d'une impartiale écran vers l'avant génétique chez la souris fournit les outils pour générer des tumeurs et d'analyser leur composition génétique, tout en réduisant le contexte de mutations particulières. La Belle au bois dormant (SB) transposon système est une de ces méthodes ^3. Le système utilise SB portable vecteurs (transposons) qui peuvent être insérés dans le génome par l'enzyme transposase. Mutations sont limités à un type de cellule spécifique grâce à l'utilisation d'un allèle conditionnel transposase qui est activé par la recombinase Cre. Il existe de nombreuses lignées de souris qui expriment la recombinase Cre dans des tissus spécifiques. En croisant l'une de ces lignes à l'allèle transposase conditionnelle (par exemple Lox-stop-Lox-SB11), le système ASR est activé uniquement dans les cellules qui expriment la recombinase Cre. La recombinase Cre sera une cassette d'accise arrêt qui bloque l'expression de l'allèle transposase, activant ainsi mutagenèse par transposon dans le type de cellule désignée. Un écran SB est initiée par l'élevage de trois souches de souris transgéniques afin que les souris expérimentales porteurs d'un allèle conditionnel transposase, un concatémère de transposons, et un allèle spécifique du tissu recombinase Cre. Ces souris sont autorisés à l'âge jusqu'à la formation de tumeurs et ils deviennent moribonds. Les souris sont ensuiteADN autopsiés et génomique est isolé à partir des tumeurs. Ensuite, l'ADN génomique est soumis à une liaison médiée par PCR (LM-PCR) qui entraîne une amplification du locus génomiques contenant un transposon SB. LM-PCR réalisée sur une seule tumeur se traduira par des centaines de amplicons distincts représentant les centaines de loci génomiques contenant insertions de transposons dans un ⁴ seule tumeur. Les insertions de transposons dans toutes les tumeurs sont analysées et sites d'insertion communs (Ciss) sont identifiés à l'aide d'une méthode statistique appropriée ^5. Gènes au sein de la CEI sont très susceptibles d'être des oncogènes ou des gènes suppresseurs de tumeurs, et sont considérés comme les gènes du cancer candidats. Les avantages de l'utilisation du système SB pour identifier les gènes responsables du cancer candidats sont les suivants: 1) le transposon peut être facilement localisé dans le génome parce que sa séquence est connue, 2) la transposition peuvent être adressées à presque n'importe quel type de cellule et 3) le transposon est capable de introduire à la fois le gain et la ^{perte-de-fonction-6} mutations. Le following protocole décrit comment concevoir et d'exécuter un écran vers l'avant génétique à l'aide du système SB transposon pour identifier les gènes responsables du cancer candidats (Figure 1).