Tetrasiklin-indüklenebilir (Tet-on) shRNA veya cDNA Expression Durağan İnsan Hücre Üretimi

Memeli hücre biyolojisi alanında önemli bir yaklaşımı gösterir etmek amacı ile, seçilen hücre hatları ilgi genlerinin ifadesi manipülasyon bir ya da bu genin geçici / kararlı ekspresyonu ya da devirme kullanılarak gen fonksiyonu (ler) in çeşitli ilgi. Ne yazık ki, çeşitli hücre biyolojik araştırmalar için bu yaklaşımın uygun olduğunda hücre büyümesi / çoğalması kusurları veya istenmeyen hücre farklılaşmasında gen ekspresyonu sonucu manipülasyonlar. Bu nedenle, araştırmacılar E. alınan Tetrasiklin repressör proteini (Tetr), adapte olması coli, tetrasiklin direnci operon ^{1, 2,3,} memeli hücrelerinde cDNA ifade etmek için çok verimli ve sıkı düzenleyici sistemleri üretmek için. Kısacası, Tetr de TO tetrasiklin (Tet-off sistemi olarak adlandırılır) ilavesinden sonra yükseltici bölgesinde Tet-operatör (TO) bağlanarak veya (2) bağlama ile transkripsiyon (1) blok başlatma ya da için modifiye edilmiştir ttetrasiklin onun yokluğunda (sistem Tet-on adlandırılır) (Şekil 1). Tet-off sistemi tetrasiklin sürekli varlığı (hangi doku hücre kültürü ortamında yaklaşık 24 saat bir yarılanma ömrüne sahiptir) gerektirir rahatsızlık Verilen Tet-sistem daha kapsamlı çok sıkı geliştirme sonuçlanan optimize edilmiştir ve cDNA ifade vektörü için etkili sistemler burada kullanılan şekliyle.

Yakında kısa saç tokası RNA'lar (shRNAs) eksprese ⁴ memeli hücrelerinde, vektörler gen demonte için RNA interferans (RNAi) kurulması sonrası siRNA'lar ^5-11 çok benzer işlevi tanımlanmıştır. Gen hedefleri hücresel hayatta kalmak için gerekli olan zaman stabil tükenmesi mümkün değildir Bununla beraber, bu shRNA aracılı knockdown yaklaşımları, konvansiyonel nakavt stratejiler aynı sınırlama var. Bu sınırlandırmayı aşmak için, van de Wetering ark. ^12. shRNA ekspresyon vektörü pSUPER modifiye ⁵ Burada, biz verimli üretmek için bir yöntem tarif istikrarlı insan Tet-on güvenilir indüklenebilir aşırı veya ilgi gen tükenmesi ya götürmek hücre hatları. Bu yöntemi kullanarak, başarılı yarattı Tet-önemli ölçüde sentrozom ^13,14 ve ^15,16 sinyalizasyon apoptoz MST / hMOB / NDR çağlayan analizi kolaylaştırdı hücre hatları. Bu yazıda, tercih edilen bizim vektörleri tarif verimli üretilmesi için gerekli olan iki ardışık işleme adımları tanımlayan ek olarak insan Tet-on hücre hatları (Şekil 2). Dahası, nesil için bir protokol taslağını yanısıra insan Tet-on hücre hatları, biz kritik teknik prosedürleri ile ilgili yönlerini ve karakterizasyonu hücreleri Tet-üzerinde görüşecek.