Microscopie corrélative pour l'analyse structurale 3D des interactions dynamiques

Tomographie cryo-électronique (cryoET) permet la visualisation 3D des structures cellulaires à la résolution moléculaire dans un état ​​proche de l'physiologique ^1. Toutefois, la visualisation directe des complexes viraux individuels dans leur environnement cellulaire hôte avec cryoET est difficile ^2, en raison de la nature peu fréquente et dynamique de l'entrée virale, en particulier dans le cas de HIV-1. Tandis que l'imagerie des cellules vivantes time-lapse a donné beaucoup d'informations sur de nombreux aspects du cycle de vie du VIH-1 ^3-7, la résolution offerte par microscopie de cellules vivantes est limitée (~ 200 nm). Notre travail visait à développer une méthode de corrélation qui permet la visualisation directe des événements précoces de l'infection au VIH-1 en combinant microscopie fluorescente des cellules vivantes, la cryo-microscopie fluorescente, et cryoET. De cette manière, les signaux des cellules vivantes et cryo-fluorescent peuvent être utilisés pour guider avec précision l'échantillonnage en cryoET. En outre, des informations structurales obtenues cryoET peut be complétée avec les données fonctionnelles dynamiques acquises par imagerie des cellules vivantes de fluorescent cible marquée.

Dans cet article, vidéo, nous fournissons des méthodes et des protocoles détaillés de l'enquête structurelle du VIH-1 et interactions de la cellule hôte en utilisant l'imagerie des cellules vivantes 3D corrélative à grande vitesse et haute résolution cryoET analyse structurelle. Des cellules HeLa infectées avec des particules de VIH-1 ont été caractérisés d'abord par microscopie confocale de cellules vivantes, et la région contenant la même particule virale ont ensuite été analysées par tomographie cryo-électronique pour plus de détails structuraux 3D. La corrélation entre les deux ensembles de données d'imagerie, l'imagerie optique et l'imagerie électronique, a été réalisé en utilisant une étape de microscopie optique de fluorescence cryo-maison-bâti. L'approche décrite ici sera utile, non seulement pour l'étude des interactions virus-cellule hôte, mais aussi pour des applications plus larges de la biologie cellulaire, tels que la signalisation cellulaire, le trafic de récepteur membranaire, et de nombreux autres processus cellulaires dynamiques. </ P>