غشاء المحتملة صبغ التصوير من بطني إنسي المهاد الخلايا العصبية من الفئران الكبار لدراسة الجلوكوز الاستشعار

Published: November 27th, 2013

DOI:

10.3791/50861

Reema P. Vazirani¹, Xavier Fioramonti², Vanessa H. Routh¹

¹Department of Pharmacology and Physiology, Rutgers New Jersey Medical School, ²Center for Taste and Feeding Behavior, Universite de Bourgogne

نشاط الخلايا العصبية واحد من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين الكبار يمكن دراستها عن طريق الفصل بين الخلايا العصبية من مناطق محددة في الدماغ واستخدام الغشاء الفلورسنت التصوير صبغ المحتملة. من خلال ردود اختبار للتغيرات في الجلوكوز، وهذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة حساسية الجلوكوز من الخلايا العصبية الكبار طائي بطني إنسي.

وغالبا ما يتم إجراء دراسات من نشاط الخلايا العصبية باستخدام الخلايا العصبية من القوارض أقل من 2 شهرا من العمر بسبب الصعوبات التقنية المرتبطة بزيادة النسيج الضام، وانخفضت قابلية الخلايا العصبية التي تحدث مع التقدم في العمر. هنا، نحن تصف منهجية لتفكك الخلايا العصبية طائي صحية من الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين الكبار. القدرة على دراسة الخلايا العصبية من الفئران البالغات من العمر يسمح باستخدام نماذج المرض التي تظهر في سن متأخرة، وربما يكون أكثر دقة تنمويا للدراسات معينة. التصوير مضان من الخلايا العصبية فصلها يمكن استخدامها لدراسة النشاط من السكان من الخلايا العصبية، بدلا من استخدام الكهربية لدراسة الخلايا العصبية واحدة. هذا هو مفيدة بشكل خاص عند دراسة السكان غير متجانسة في الخلايا العصبية التي نوع الخلايا العصبية المرجوة أمر نادر الحدوث مثل الجلوكوز الاستشعار عن الخلايا العصبية طائي. نحن استخدام غشاء المحتملة التصوير صبغ الخلايا العصبية الكبار طائي بطني إنسي لدراسة ردودهم على تشاnges في الجلوكوز خارج الخلية. ويعتقد أن الخلايا العصبية الجلوكوز الاستشعار للعب دور في التنظيم المركزي لتوازن الطاقة. القدرة على دراسة استشعار الجلوكوز في القوارض الكبار مفيد بشكل خاص منذ هيمنة الأمراض المتصلة توازن الطاقة المختلة وظيفيا (على سبيل المثال. السمنة) تزيد مع تقدم العمر.

الدماغ وينظم توازن الطاقة من خلال الغدد الصم العصبية والجهاز العصبي اللاإرادي. ما تحت المهاد بطني إنسي (VMH)، التي تتألف من نواة بطني إنسي (VMN) والنواة المقوسة (ARC)، المهم لتنظيم المركزي للتوازن الطاقة. الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز المتخصصة، ضمن VMH، ربط نشاط الخلايا العصبية الطرفية والجلوكوز التوازن ^1. هناك نوعان من السكر في الخلايا العصبية الاستشعار؛ الجلوكوز متحمس (GE) زيادة الخلايا العصبية في حين الجلوكوز مستعمل (GI) الخلايا العصبية تقليل نشاطهم مع زيادة الجلوكوز خارج الخلية. يتم دراسة الخلايا العصبية VMH الجلوكوز الاستشعار عن بعد باستخدام عموما الكهربية أو الكالسيوم / غشاء المحتملة التصوير صبغة حساسة. ....

1. جماعة من الحيوان

تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام في جامعة الطب وطب الأسنان في نيوجيرسي.
البيت مجموعة الذكور C57BL / 6 الفئران على 12 ساعة الجدول ا.......

تشريح دقيق للVMH بعيدا عن المناطق الأخرى طائي المهم للحصول على نتائج متسقة. إدراج مجالات أخرى يمكن أن يخفف من السكان العصبية VMH، وتغيير٪ من الخلايا العصبية استقطابها المحسوبة. وعلاوة على ذلك، تم تحديد الخلايا العصبية الاستشعار الجلوكوز في المناطق طائي أخرى، مثل منطقة.......

المفتاح لتكون قادرة على دراسة نشاط الخلايا العصبية من الفئران الكبار هو القدرة على فصل الخلايا العصبية السليمة. تفكك الخلايا العصبية طائي من الفئران الكبار هو أكثر صعوبة في عدة خطوات أساسية في البروتوكول مقارنة مع الخلايا العصبية من الفئران الأحداث. تغلبنا على هذه ?.......

NIH R01 DK55619، المعاهد الوطنية للصحة R21 CA139063

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)	Invitrogen	15140	other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm)	Millipore		other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips	Warner	#1 25mm round
18 mm Glass coverslips	Warner	#1 18mm round
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 minus insulin (50x)	Invitrogen	0050129SA
Razor blade	VWR	55411
Vibratome & cooling chamber	Vibratome	Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades	Polysciences	22370	injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension	Worthington	LS003124
BSA, suitable for cell culture	Sigma		other vendor acceptable
DNAse, for cell culture	Invitrogen		other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
Membrane Potential Dye (blue)	Molecular Devices	R8042
In-line heater	Warner	SF-28
Syringe pumps	WPI	sp100i	other vendor acceptable
Closed chamber	Warner	RC-43C
Polyethylene tubing	Warner	PE-90
Metamorph	Molecular Devices		alternate image analysis software acceptable
Microscope	Olympus	BX61 WI	used with 10X objective
Camera	Photometrics	Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set	Chroma	41007a
Illumination System	Sutter Instruments	Lambda DG-4

Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).