ממברנה דיי הדמיה אפשרית של ventromedial היפותלמוס נוירונים מעכברים בוגרים ללמוד גלוקוז חישה

Published: November 27th, 2013

DOI:

10.3791/50861

Reema P. Vazirani¹, Xavier Fioramonti², Vanessa H. Routh¹

¹Department of Pharmacology and Physiology, Rutgers New Jersey Medical School, ²Center for Taste and Feeding Behavior, Universite de Bourgogne

פעילותם של נוירונים בודדים מעכברים בגיל מבוגרים ניתן ללמוד על ידי מתנער נוירונים מאזורים מסוימים במוח ובאמצעות הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה ניאון. על ידי תגובות בדיקות לשינויים ברמת סוכר, טכניקה זו יכולה לשמש כדי לחקור את רגישות הגלוקוז של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים.

מחקרים של פעילות עצבית לעתים קרובות מבוצעים באמצעות נוירונים ממכרסמים פחות מ -2 חודשים של גיל בשל הקשיים הטכניים הקשורים לרקמת חיבור גוברת וירידה בכדאיות עצבית המתרחשות עם גיל. כאן, אנו מתארים מתודולוגיה לניתוק של נוירונים ההיפותלמוס בריאים מעכברים בגיל מבוגר. היכולת ללמוד נוירונים מעכברים בוגרים בגיל מאפשרת שימוש במודלי מחלה המתבטא בגיל מאוחר יותר והוא עשוי להיות יותר מבחינה התפתחותית מדויק ללימודים מסוימים. דימות פלואורסצנטי של נוירונים ניתקו יכולה לשמש כדי לחקור את הפעילות של אוכלוסייה של נוירונים, בניגוד לשימוש באלקטרופיזיולוגיה ללמוד נוירון בודד. התכונה זו שימושית במיוחד כאשר לומד אוכלוסייה עצבית הטרוגניות שבהן הסוג העצבי הרצוי הוא נדיר כגון לתאי עצב גלוקוז חישת ההיפותלמוס. אנו מנוצלים הדמיה לצבוע פוטנציאל הממברנה של נוירונים ההיפותלמוס ventromedial מבוגרים ללמוד את התגובות שלהם לצ'הnges ברמת הגלוקוז החוץ תאי. הם האמינו נוירונים חישת הגלוקוז לשחק תפקיד בויסות מאזן אנרגיה מרכזית. היכולת ללמוד חישת הגלוקוז במכרסמים מבוגרים היא שימושית במיוחד מאז דומיננטיות של מחלות הקשורות לאיזון מתפקד אנרגיה (למשל. השמנת יתר) עם עלייה בגיל.

המוח מווסת הומאוסטזיס אנרגיה באמצעות נוירואנדוקריניים ומערכת עצבים אוטונומית. ההיפותלמוס ventromedial (VMH), מורכב מגרעין ventromedial (VMN) וגרעין מקושת (ARC), הוא חשוב לרגולציה של הומאוסטזיס אנרגיה המרכזית. נוירונים חישת הגלוקוז מיוחדים, בתוך VMH, לקשר פעילות עצבית והומאוסטזיס הגלוקוז פריפרית ^1. ישנם שני סוגים של גלוקוז חישת תאי עצב; גלוקוז נרגשים (GE) נוירונים להגדיל בעוד גלוקוז עכבות הנוירונים (GI) להקטין את פעילותם עם עלייה ברמת סוכר תאית. נוירונים גלוקוז VMH חישה בדרך כלל למדו באמצעות אלקטרופיזיולוגיה או הדמיה צבע סיד / קרום פוטנציאלי רגישה.

ט....

1. בעלי חיים

כל ההליכים אושרו על ידי הוועדה המוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש באוניברסיטה לרפואה ורפואת השיניים של ניו ג'רזי.
זכר בית הקבוצה עכברי C57BL / 6 בלוח זמנים חשוך שעות light/12 שעות 12 וגישה.......

הנתיחה המדויקת של VMH הרחק מאזורי ההיפותלמוס אחרים היא חשובה כדי להשיג תוצאות עקביות. הכללת אזורים אחרים יכולה לדלל את האוכלוסייה העצבית VMH, שינוי% מתאי עצב depolarized המחושב. יתר על כן, תאי עצב חישת הגלוקוז זוהו באזורי ההיפותלמוס אחרים, כגון ההיפותלמוס לרוחב, שעשויות להיות.......

המפתח ליכולת ללמוד פעילות של נוירונים מעכברים בוגרים הוא היכולת לנתק את תאי העצב בריאים. דיסוציאציה של נוירונים ההיפותלמוס מעכברים בוגרים קשה יותר בכמה שלבים עיקריים בפרוטוקול בהשוואה לנוירונים מעכברים לנוער. יש לנו להתגבר על בעיה זו במספר הדרכים. מה שהופך את פרוסו.......

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

....

Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)	Invitrogen	15140	other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm)	Millipore		other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips	Warner	#1 25mm round
18 mm Glass coverslips	Warner	#1 18mm round
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 minus insulin (50x)	Invitrogen	0050129SA
Razor blade	VWR	55411
Vibratome & cooling chamber	Vibratome	Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades	Polysciences	22370	injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension	Worthington	LS003124
BSA, suitable for cell culture	Sigma		other vendor acceptable
DNAse, for cell culture	Invitrogen		other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
Membrane Potential Dye (blue)	Molecular Devices	R8042
In-line heater	Warner	SF-28
Syringe pumps	WPI	sp100i	other vendor acceptable
Closed chamber	Warner	RC-43C
Polyethylene tubing	Warner	PE-90
Metamorph	Molecular Devices		alternate image analysis software acceptable
Microscope	Olympus	BX61 WI	used with 10X objective
Camera	Photometrics	Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set	Chroma	41007a
Illumination System	Sutter Instruments	Lambda DG-4

Routh, V. H. Glucose-sensing neurons: are they physiologically relevant?. Physiol. Behav. 76, 403-413 (2002).
Canabal, D. D., Potian, J. G., Duran, R. G., McArdle, J. J., Routh, V. H. Hyperglycemia impairs glucose and insulin regulation of nitric oxide production in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. Am. J. Physiol. 293, 592-600 (2007).
Canabal, D. D., et al. Glucose, insulin, and leptin signaling pathways modulate nitric oxide synthesis in glucose-inhibited neurons in the ventromedial hypothalamus. American journal of physiology. Reg. Integr. Comp. Physiol. 292, 1418-1428 (2007).
Murphy, B. A., Fakira, K. A., Song, Z., Beuve, A., Routh, V. H. AMP-activated protein kinase and nitric oxide regulate the glucose sensitivity of ventromedial hypothalamic glucose-inhibited neurons. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 297, C750-C758 (2009).
Murphy, B. A., et al. Fasting enhances the response of arcuate neuropeptide Y-glucose-inhibited neurons to decreased extracellular glucose. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 296, C746-C756 (2009).
Kang, L., et al. Glucokinase is a critical regulator of ventromedial hypothalamic neuronal glucosensing. Diabetes. 55, 412-420 (2006).
Kang, L., et al. Prior hypoglycemia enhances glucose responsiveness in some ventromedial hypothalamic glucosensing neurons. Reg. Integr. Comp. Physiol. 294, R784-R792 (2008).
Paxinos, G., Franklin, K. B. J. . The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , (2004).
Paxinos, G., Watson, C. . The Rat Brain in Stereotaxic Coordinates. , (1998).
Song, Z., Levin, B. E., McArdle, J. J., Bakhos, N., Routh, V. H. Convergence of pre- and postsynaptic influences on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 50, 2673-2681 (2001).
Song, Z., Routh, V. H. Differential effects of glucose and lactate on glucosensing neurons in the ventromedial hypothalamic nucleus. Diabetes. 54, 15-22 (2005).