Potenziale di membrana Dye Imaging di ventromediale dell'ipotalamo neuroni da topi adulti per studiare glucosio Sensing

Published: November 27th, 2013

DOI:

10.3791/50861

Reema P. Vazirani¹, Xavier Fioramonti², Vanessa H. Routh¹

¹Department of Pharmacology and Physiology, Rutgers New Jersey Medical School, ²Center for Taste and Feeding Behavior, Universite de Bourgogne

L'attività di singoli neuroni di topi-adulti di età può essere studiato dissociandosi neuroni da regioni specifiche del cervello e l'utilizzo di membrana fluorescenti potenziale di imaging colorante. Da sperimentazioni risposte alle modifiche del glucosio, questa tecnica può essere utilizzata per studiare la sensibilità glucosio di adulti neuroni ipotalamici ventromedial.

Studi di attività neuronale vengono spesso eseguite utilizzando i neuroni di roditori meno di due mesi di età a causa delle difficoltà tecniche connesse con l'aumento del tessuto connettivo e diminuiscono la vitalità neuronale che si verificano con l'età. Qui, descriviamo una metodologia per la dissociazione di sano neuroni ipotalamici di topi adulti di età. La capacità di studiare i neuroni da topi adulti età consente l'utilizzo di modelli di malattia che si manifesta in età più avanzata e potrebbe essere più evolutivamente accurato per alcuni studi. Imaging di fluorescenza dei neuroni dissociati può essere usato per studiare l'attività di una popolazione di neuroni, anziché utilizzare elettrofisiologia per studiare un singolo neurone. Ciò è particolarmente utile quando si studia una popolazione eterogenea neuronale in cui il tipo neuronale desiderato è raro come per i neuroni ipotalamici glucosio sensing. Abbiamo utilizzato potenziale di membrana di imaging tintura di adulti neuroni ipotalamici ventromedial di studiare le loro risposte a chaNGES in glucosio extracellulare. Neuroni sensori del glucosio si ritiene di svolgere un ruolo centrale nella regolazione del bilancio energetico. La possibilità di studiare sensing del glucosio nei roditori adulti è particolarmente utile in quanto la prevalenza di malattie legate al bilancio energetico disfunzionale (ad es. Obesità) aumenta con l'età.

Il cervello regola l'omeostasi energetica attraverso il sistema neuroendocrino e nervoso autonomo. L'ipotalamo ventromediale (VMH), composto dal nucleo ventromediale (VMN) e il nucleo arcuato (ARC), è importante per la regolazione centrale dell'omeostasi energetica. Specializzati neuroni sensori del glucosio, all'interno del VMH, attività collegamento neuronale e periferico omeostasi del glucosio ^1. Ci sono due tipi di glucosio sensing neuroni; glucosio eccitati (GE) neuroni aumentano mentre il glucosio inibita (GI) neuroni diminuiscono la loro attività di aumenti di glucosio extracellulare. Neuroni rilevamento VMH glucosio sono generalment....

1. Animali

Tutte le procedure sono state approvate dal Comitato Istituzionale cura degli animali ed uso presso l'Università di Medicina e Odontoiatria del New Jersey.
Casa di gruppo maschile C57BL / 6 topi su un light/12 hr pianificazione buio 12 ore e permettere ad libitum accesso ad acqua e cibo. Sacrifica a 4-5 mesi di età. L'eutanasia dei topi è stata effettuata utilizzando il piano chirurgico di anestesia e una forma secondaria di eutanasia (cioè penetrante incisio.......

La dissezione precisa del VMH lontano da altre aree ipotalamiche è importante ottenere risultati coerenti. L'inclusione di altre aree potrebbe diluire la popolazione neuronale VMH, cambiando la% dei neuroni depolarizzati calcolati. Inoltre, neuroni sensori di glucosio sono stati identificati in altre regioni ipotalamici, quali l'ipotalamo laterale, che possono differire funzionalmente e meccanicamente da VMH glucosio sensing neuroni. Figura 1 illustra le posizioni anatomiche corrette per una co.......

La chiave per poter studiare l'attività dei neuroni da topi adulti è la capacità di dissociare neuroni sani. Dissociazione dei neuroni ipotalamici di topi adulti è più difficile in diversi passaggi chiave nel protocollo rispetto ai neuroni di topi giovani. Abbiamo superare questo problema in vari modi. Fare fette spesse 500 micron di cervello riduce al minimo i danni meccanici ai neuroni rispetto ai soliti 250-350 micron fette utilizzati per il tessuto cerebrale di topi più giovani. Tuttavia, fette spesse rich.......

NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

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Name	Company	Catalog Number	Comments
Neurobasal-A Medium (Custom)	Invitrogen	0050128DJ	custom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom)	BrainBits		custom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)	Invitrogen	15140	other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm)	Millipore		other vendors acceptable
25 mm Glass coverslips	Warner	#1 25mm round
18 mm Glass coverslips	Warner	#1 18mm round
GlutaMAX	Invitrogen	35050
B27 minus insulin (50x)	Invitrogen	0050129SA
Razor blade	VWR	55411
Vibratome & cooling chamber	Vibratome	Series 1000 Sectioning system
Vibratome blades	Polysciences	22370	injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspension	Worthington	LS003124
BSA, suitable for cell culture	Sigma		other vendor acceptable
DNAse, for cell culture	Invitrogen		other vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm	Bellco Glass	2090-00608
Membrane Potential Dye (blue)	Molecular Devices	R8042
In-line heater	Warner	SF-28
Syringe pumps	WPI	sp100i	other vendor acceptable
Closed chamber	Warner	RC-43C
Polyethylene tubing	Warner	PE-90
Metamorph	Molecular Devices		alternate image analysis software acceptable
Microscope	Olympus	BX61 WI	used with 10X objective
Camera	Photometrics	Cool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter Set	Chroma	41007a
Illumination System	Sutter Instruments	Lambda DG-4

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