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Neuroscience

Potencial de Membrana Tinte Imaging de ventromedial del hipotálamo neuronas de ratones adultos para el Estudio de la glucosa Sensing

Published: November 27th, 2013

DOI:

10.3791/50861

1Department of Pharmacology and Physiology, Rutgers New Jersey Medical School, 2Center for Taste and Feeding Behavior, Universite de Bourgogne

La actividad de las neuronas individuales de ratones adultos en edad puede ser estudiado por disociar las neuronas de regiones específicas del cerebro y el uso de membrana fluorescente potencial de formación de imágenes de colorante. Por respuestas de prueba a cambios en la glucosa, esta técnica se puede utilizar para estudiar la sensibilidad a la glucosa de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos.

Estudios de la actividad neuronal se realizan a menudo utilizando las neuronas de los roedores de menos de 2 meses de edad, debido a las dificultades técnicas asociadas con el aumento de tejido conectivo y la disminución de la viabilidad neuronal que se producen con la edad. Aquí se describe una metodología para la disociación de las neuronas hipotalámicas sanos de ratones adultos en edad. La capacidad para estudiar las neuronas de los ratones de edad adulta permite el uso de modelos de enfermedades que se manifiestan a una edad más tarde y podría ser de desarrollo más preciso para ciertos estudios. Imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas se puede utilizar para estudiar la actividad de una población de neuronas, en lugar de utilizar la electrofisiología para estudiar una sola neurona. Esto es particularmente útil cuando el estudio de una población neuronal heterogéneo en el que el tipo neuronal deseada es rara como para las neuronas hipotalámicas de glucosa de detección. Hemos utilizado el potencial de membrana de imagen de colorante de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos para estudiar sus respuestas a changes en glucosa extracelular. Neuronas detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en la regulación central del balance de energía. La capacidad para estudiar detección de glucosa en roedores adultos es particularmente útil ya que el predominio de enfermedades relacionadas con el balance de energía disfuncional (por ejemplo. La obesidad) aumentar con la edad.

El cerebro regula la homeostasis de la energía a través de la neuroendocrino y el sistema nervioso autónomo. El hipotálamo ventromedial (HVM), compuesto por el núcleo ventromedial (VMN) y el núcleo arqueado (ARC), es importante para la regulación central de la homeostasis energética. Neuronas de detección de glucosa especializados, dentro del hipotálamo ventromedial, vinculan la actividad neuronal y periférico homeostasis de la glucosa 1. Hay dos tipos de glucosa de detección de glucosa en las neuronas; excitado (GE), las neuronas aumentan mientras que la glucosa inhibe (GI), las neuronas disminuyen su actividad a medida que aumenta extracelulares de gluco....

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1. Animales

  1. Todos los procedimientos fueron aprobados por el Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso de la Universidad de Medicina y Odontología de Nueva Jersey.
  2. Casa Group masculino C57BL / 6 ratones en un horario oscuro hr light/12 12 horas y permitir el acceso ad libitum al agua y los alimentos. Sacrificar a los 4-5 meses de edad. La eutanasia de los ratones se realizó utilizando el plano quirúrgico de anestesia y una forma secundaria de la eutanasia (es decir, pen.......

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La disección precisa de la VMH lejos de otras zonas del hipotálamo es importante para obtener resultados consistentes. La inclusión de otras áreas podría diluir la población neuronal VMH, cambiando el% de neuronas despolarizadas calculados. Además, las neuronas de detección de glucosa se ​​han identificado en otras regiones hipotalámicas, tales como el hipotálamo lateral, la cual puede diferir funcionalmente y mecánicamente a partir de glucosa detección de neuronas VMH. Figura 1 ilustra .......

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La clave para ser capaz de estudiar la actividad de las neuronas de ratones adultos es la capacidad de disociar las neuronas sanas. La disociación de las neuronas del hipotálamo de ratones adultos es más difícil en varios pasos clave en el protocolo en comparación con las neuronas de ratones jóvenes. Hemos superar este problema en un número de maneras. Hacer rodajas gruesas 500 micras cerebrales minimiza los daños mecánicos a las neuronas en comparación con los habituales 250-350 micras rodajas utilizados para.......

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NIH R01 DK55619, NIH R21 CA139063

....

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NameCompanyCatalog NumberComments
Neurobasal-A Medium (Custom)Invitrogen0050128DJcustom made glucose free
Hibernate-A Medium (Custom)BrainBitscustom made glucose free
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml)Invitrogen15140other vendors acceptable
Stericup vacuum filter units (0.22 μm)Milliporeother vendors acceptable
25 mm Glass coverslipsWarner#1 25mm round
18 mm Glass coverslipsWarner#1 18mm round
GlutaMAXInvitrogen35050
B27 minus insulin (50x)Invitrogen0050129SA
Razor bladeVWR55411
Vibratome & cooling chamberVibratomeSeries 1000 Sectioning system
Vibratome bladesPolysciences22370injector or double edge blades from other vendors acceptable
Papain, suspensionWorthingtonLS003124
BSA, suitable for cell cultureSigmaother vendor acceptable
DNAse, for cell cultureInvitrogenother vendor acceptable
cloning cylinders, 6 mm x 8 mmBellco Glass2090-00608
Membrane Potential Dye (blue)Molecular DevicesR8042
In-line heaterWarnerSF-28
Syringe pumpsWPIsp100iother vendor acceptable
Closed chamberWarnerRC-43C
Polyethylene tubingWarnerPE-90
MetamorphMolecular Devicesalternate image analysis software acceptable
MicroscopeOlympusBX61 WI

used with 10X objective

CameraPhotometricsCool Snap HQ
Narrow Cy3 Filter SetChroma41007a
Illumination SystemSutter InstrumentsLambda DG-4

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Neurociencia

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