Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Representative Results
Discussion
Acknowledgements
Materials
References
Neuroscience
La actividad de las neuronas individuales de ratones adultos en edad puede ser estudiado por disociar las neuronas de regiones específicas del cerebro y el uso de membrana fluorescente potencial de formación de imágenes de colorante. Por respuestas de prueba a cambios en la glucosa, esta técnica se puede utilizar para estudiar la sensibilidad a la glucosa de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos.
Estudios de la actividad neuronal se realizan a menudo utilizando las neuronas de los roedores de menos de 2 meses de edad, debido a las dificultades técnicas asociadas con el aumento de tejido conectivo y la disminución de la viabilidad neuronal que se producen con la edad. Aquí se describe una metodología para la disociación de las neuronas hipotalámicas sanos de ratones adultos en edad. La capacidad para estudiar las neuronas de los ratones de edad adulta permite el uso de modelos de enfermedades que se manifiestan a una edad más tarde y podría ser de desarrollo más preciso para ciertos estudios. Imágenes de fluorescencia de las neuronas disociadas se puede utilizar para estudiar la actividad de una población de neuronas, en lugar de utilizar la electrofisiología para estudiar una sola neurona. Esto es particularmente útil cuando el estudio de una población neuronal heterogéneo en el que el tipo neuronal deseada es rara como para las neuronas hipotalámicas de glucosa de detección. Hemos utilizado el potencial de membrana de imagen de colorante de las neuronas del hipotálamo ventromedial adultos para estudiar sus respuestas a changes en glucosa extracelular. Neuronas detección de glucosa se cree que desempeñan un papel en la regulación central del balance de energía. La capacidad para estudiar detección de glucosa en roedores adultos es particularmente útil ya que el predominio de enfermedades relacionadas con el balance de energía disfuncional (por ejemplo. La obesidad) aumentar con la edad.
El cerebro regula la homeostasis de la energía a través de la neuroendocrino y el sistema nervioso autónomo. El hipotálamo ventromedial (HVM), compuesto por el núcleo ventromedial (VMN) y el núcleo arqueado (ARC), es importante para la regulación central de la homeostasis energética. Neuronas de detección de glucosa especializados, dentro del hipotálamo ventromedial, vinculan la actividad neuronal y periférico homeostasis de la glucosa 1. Hay dos tipos de glucosa de detección de glucosa en las neuronas; excitado (GE), las neuronas aumentan mientras que la glucosa inhibe (GI), las neuronas disminuyen su actividad a medida que aumenta extracelulares de gluco....
1. Animales
La disección precisa de la VMH lejos de otras zonas del hipotálamo es importante para obtener resultados consistentes. La inclusión de otras áreas podría diluir la población neuronal VMH, cambiando el% de neuronas despolarizadas calculados. Además, las neuronas de detección de glucosa se han identificado en otras regiones hipotalámicas, tales como el hipotálamo lateral, la cual puede diferir funcionalmente y mecánicamente a partir de glucosa detección de neuronas VMH. Figura 1 ilustra .......
La clave para ser capaz de estudiar la actividad de las neuronas de ratones adultos es la capacidad de disociar las neuronas sanas. La disociación de las neuronas del hipotálamo de ratones adultos es más difícil en varios pasos clave en el protocolo en comparación con las neuronas de ratones jóvenes. Hemos superar este problema en un número de maneras. Hacer rodajas gruesas 500 micras cerebrales minimiza los daños mecánicos a las neuronas en comparación con los habituales 250-350 micras rodajas utilizados para.......
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Neurobasal-A Medium (Custom) | Invitrogen | 0050128DJ | custom made glucose free |
Hibernate-A Medium (Custom) | BrainBits | custom made glucose free | |
Penicillin streptomycin (20,000 U/ml) | Invitrogen | 15140 | other vendors acceptable |
Stericup vacuum filter units (0.22 μm) | Millipore | other vendors acceptable | |
25 mm Glass coverslips | Warner | #1 25mm round | |
18 mm Glass coverslips | Warner | #1 18mm round | |
GlutaMAX | Invitrogen | 35050 | |
B27 minus insulin (50x) | Invitrogen | 0050129SA | |
Razor blade | VWR | 55411 | |
Vibratome & cooling chamber | Vibratome | Series 1000 Sectioning system | |
Vibratome blades | Polysciences | 22370 | injector or double edge blades from other vendors acceptable |
Papain, suspension | Worthington | LS003124 | |
BSA, suitable for cell culture | Sigma | other vendor acceptable | |
DNAse, for cell culture | Invitrogen | other vendor acceptable | |
cloning cylinders, 6 mm x 8 mm | Bellco Glass | 2090-00608 | |
Membrane Potential Dye (blue) | Molecular Devices | R8042 | |
In-line heater | Warner | SF-28 | |
Syringe pumps | WPI | sp100i | other vendor acceptable |
Closed chamber | Warner | RC-43C | |
Polyethylene tubing | Warner | PE-90 | |
Metamorph | Molecular Devices | alternate image analysis software acceptable | |
Microscope | Olympus | BX61 WI |
used with 10X objective |
Camera | Photometrics | Cool Snap HQ | |
Narrow Cy3 Filter Set | Chroma | 41007a | |
Illumination System | Sutter Instruments | Lambda DG-4 |
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